EXPERIMENTÁLNA ŠTÚDIA NA ZVIERATÁCH VO VIVOTESTOVANÍ BIODEGRADABLÍK ZALOŽENÝCH NA FARMACONE
1 Klinika a poliklinika pre všeobecnú, hrudníkovú, vaskulárnu a transplantačnú chirurgiu Lekárskej univerzity v Rostocku EXPERIMENTÁLNA ŠTÚDIA ZVIERAT NA TESTOVANÍ BIODEGRADOVATEĽNÝCH POLYLAKTIDOV OBSAHUJÚCICH FARMACÓNOM Úvodná dizertačná práca pre získanie akademického titulu na univerzite v Rostocku, narodená doktorka medicíny v Krasnodare. Rostock, 2007 urna: nbn: de: gbv: 28-diss
2 Dekan: Prof. Dr. med Wolfgang Schareck 1. recenzent: 2. recenzent: 3. recenzent:
3 Vďačnosť mojim rodičom
4 OBSAH. 1 1 ÚVOD Stenty vo vaskulárnej chirurgii Zavedené indikácie a inovatívne zavedenie stentu krčnej tepny Ideálny stent Kovový stent Problémy implantácie stentu: Trombóza a restenóza Stratégie riešenia Antitrombotiká Kovový stent s uvoľňovaním liečiva: Sirolimus Biologicky odbúrateľné stenty Kovový stent A polymérny stent s uvoľňovaním liečiva MATERIÁLY METOD RELEASE Stenty Testované zvieratá a predoperačný manažment Anestézia, intubácia a ventilácia Monitorovanie a medikácia Chirurgický zákrok Model iliakálnych anastomóz Model ACC Pooperačný manažment a sledovanie Odber vzoriek a histológia Štatistické hodnotenie VÝSLEDKY Model iliakálnych anastomóz Chirurgický zákrok Sledovanie Histologické hodnotenie Model ACC Chirurgický zákrok Histologické hodnotenie
5 5 DISKUSIA Model ošípaných Biologické a fyzikálne vlastnosti stentu PLLA Testovanie polymérneho stentu in vivo ZHRNUTIE ZOZNAM LITERATÚRY ZOZNAM SKRATIEK ZOZNAM OBRÁZKOV ZOZNAM TABULIEK VEDECKÝ VÝKON AKTUÁLNY SÚČASNÝ KURIKULUM
12 Podporná funkcia kovového stentu môže do značnej miery prispieť k prevencii elastického spätného rázu, ale nemôže inhibovať neointimálnu hyperpláziu, ktorá je ďalším rozhodujúcim faktorom v patogenéze restenózy stentu [47]. Obr. 1: Restenóza stentu v dôsledku neointimálnej hyperplázie, vľavo: histologický prierez, vpravo: makroskopický prierez, [s láskavým dovolením MB Leona, Presbyterian Hospital, New York, USA.] To ukazuje reakciu steny cievy na najjemnejšie mechanické lézie. Po endoteliálnej denudácii vedie vystavenie subendoteliálnych štruktúr krvi k zápalovej reakcii cievnej steny. Uvoľňovaním cytokínov a rastových faktorov, ako sú rastový faktor odvodený z krvných doštičiek (PDGF), epidermálny rastový faktor (EGF), ß transformujúci rastový faktor (TGF ß) a heparinázy, vedie k aktivácii a proliferácii buniek hladkého svalstva v tunice. médiá. Po 9
14 kontrolná skupina [52]. Lokálny heparínový povlak stentov bol klinicky stanovený od publikovania štúdie BENESTENT II [53]. Kovový stent s uvoľňovaním liečiva: Aby sa znížila neointimálna hyperplázia, a tým aj restenóza stentu, má zmysel lokálne použitie terapeutických látok. Predpokladá sa, že inhibujú zápalovú reakciu cievnej steny a blokujú množenie buniek hladkého svalstva. Tabuľka 1: farmakologická činidlá Protizápalová znížiť restenózy Immunodulatoren proti migrácii inhibítory Proliferativa Reendothelisationsfaktoren dexametazón M-prednizolón interferón y-1b, leflunomid, sirolimus, takrolimus, everolimus zotarolimus mykofenolovú mizoribin cyklosporín aktinomycín metotrexát angiopeptin, vinkristín, mitomycín statíny batimastat prolylhydroxylázy, inhibítory halofuginón C-proteinázy, probukol BCP671 VEGF estradiol NO darcovia EPC protilátky 11.
22 Neointimálna hyperplázia Skóre poranenia Stupeň poranenia cievnej steny Stupeň zápalu Stupeň zápalu Zhromaždené údaje sa analyzujú, porovnávajú medzi sebou a diskutujú sa v súvislosti s in vitro vyšetreniami stentu PLLA, ktoré boli zaznamenané v Ústave pre biomedicínske inžinierstvo na univerzite v Rostocku. 19
23 3 MATERIÁL A METÓDY 3.1. Stenty Kovové stenty (Phainon 6,0 x 26 mm, priemer stojky 155 m) boli vyrobené z nehrdzavejúcej ocele (316 L) s amorfným povlakom z karbidu kremíka a potom boli sterilizované plynom. Dizajn zodpovedá komerčne dostupnému systému PEIRON (Biotronik GmbH & Co. KG, Berlín, Nemecko). Expanzia pomocou balónikového katétra prebehne v priebehu niekoľkých sekúnd až 8 bar bez rizika prasknutia stentu. Bioabsorbovateľné poly-L-laktidy (PLLA) boli vyvinuté a vyrobené v Inštitúte pre biomedicínske technológie na univerzite v Rostocku Warnemünde [16]. Obrázok 2: Balónikom expandovateľný stent PLLA pred (A) a po (B) balónikovej dilatácii Dĺžka tyče = 10 mm. 20
Na výrobu sa používa vysokomolekulárny poly L laktid (PLLA; Resomer L214, MG = g/mol, Boehringer, Ingelheim, Nemecko) bez prísad. Pri čiastočne automatizovanom procese nanášania riadeným PC (ponorné nanášanie) sa kryty jadier z nehrdzavejúcej ocele (priemer 2,8 mm, dĺžka 40 mm) pomocou potápačského robota spustia do roztoku PLLA/chloroform. Roztok sa automaticky znovu plní pomocou systému injekčných striekačiek, aby sa zabezpečilo, že ponorné jadrá sú rovnomerne navlhčené. Proces máčania sa opakuje, až kým nevznikne plášť s požadovanou hrúbkou steny 270 m. Toto sa meria bezdotykovo s dvojosovou laserovou meracou hlavou (ODAC 32 XY, ZUMBACH Electronic, Orpund, Švajčiarsko). Polymérové skúmavky sa potom vyberú z piestu skalpelom a sušia sa vo vákuu pri 40 ° C, kým sa nedosiahne obsah chloroformu nižší ako 2%. Na odstránenie zvyšného chloroformu sa použije posledný premývací proces vodou a metanolom. V druhom kroku sa potom rúrky rezajú pomocou CO2 lasera (Wild Emco Lasertec, Hallein, Rakúsko). Obrázok 3: vľavo: potápačský robot, vpravo: CO2 laser 21
25 rezov je riadených CNC. Na fixáciu sú polymérne trubice umiestnené na keramickom tŕni, ktorý umožňuje laseru pohybovať sa dopredu, dozadu a v rotácii. Všetky dráhy rezania sa prekonajú dvakrát, aby sa materiál úplne prerezal. Konečným výsledkom sú PLLA stenty s veľkosťou mm a priemerom vzpery 270 m, ktoré sa dokončia v konečnom kroku nastriekaním na roztok PLLA Sirolimus v pomere 70:30, sprejovým povlakom. Obrázok 4: Postrekovanie - nastriekanie poťahovacieho roztoku. Zloženie roztoku vyplýva z predbežných testov, ktoré ukázali, že sirolimus sa uvoľňoval iba v koncentrácii najmenej 20% [16]. Výsledný povlak Pharmakon je okolo 1,5 g/mm 2. Pokiaľ sa stent nepoužije, uskladní sa na suchom mieste pri 20 ° C, aby sa predĺžila jeho trvanlivosť. Pretože sterilizácia je spojená so znížením viskoelastických vlastností [15, 16], nie je to možné. Minútová dezinfekcia stentu etanolom sa uskutoční bezprostredne pred implantáciou. 22
31 Proces anastomózy vykonáva výlučne jeden a ten istý chirurg (C.M.B.) pomocou hranolovej lupy s 2,5-násobným zväčšením, aby sa zaručila čo najväčšia štandardizácia chirurgickej techniky. Obr.6: Implantácia bifurkačnej protézy aortobiiliakal; intraoperačný situs. Implantácia stentu je náhodná. Paralelne s prípravami na stent (3.1.) Sa na zviera zvierajú proximálna (svorka Satinski) a distálna končatina (Bulldog svorka) spoločnej iliakálnej artérie, ako aj približne 0,5 cm dlhý priečny rez končatiny upnutej protézy vo vzdialenosti 2. cm proximálne k anastomóze. Obe strany cievy sa prepláchnu rezom a prepláchnu sa heparínovým soľným roztokom. Po predbežnom natiahnutí Overholtom sa stent nalisovaný na balónikový katéter 6/40 mm (PHERON, Biotronik, Berlín, Nemecko) zavedie do stredu oblasti anastomózy a postupne sa rozširuje pod vizuálnou kontrolou. 28
32 Obrázok 7: Implantácia stentu pod vizuálnou kontrolou Stent je rozšírený nafúknutím balónikového katétra na 8 bar. Ako je opísané vyššie, kovový stent sa expanduje v priebehu niekoľkých sekúnd, zatiaľ čo expanzia PLLA stentu trvá 8 minút (1 bar/min). Po premiestnení katétra sa rez potrebný na prístup uzavrie stehmi s jedným gombíkom (Prolene 6.0 BV) a po odstránení buldoga sa odhalí bežná iliaca artéria. Nakoniec sa skontrolujú vitálne parametre zvieraťa. 29
33 Obrázok 8: Nafúknutie iliakálneho anastomotického stentu, ktorý je makroskopicky viditeľný cez stenu cievy. Po úspešnom zavedení stentov do ciev sa arteriálny katéter odstráni a aorta sa uzavrie prolénom. Nasleduje intravenózne podanie 1,5 g ampicilínu/sulbaktámu (Unacid) a vyplachovanie brucha roztokom gentamicínu NaCl, obidve na antibakteriálnu profylaxiu. Po odstránení suprapubického močového katétra s uzáverom stehom Z (Vicryl 3.0 SH) a premiestnením črevných slučiek sa retroperitoneum kontinuálne znovu otvára s 3,0. Vicrylový steh a pobrušnice sa uzavreli merersilínom. Subkutánny šev sa tiež vykonáva pomocou bežiacej verzie 3.0. Vicrylový šev, pokožka je po dezinfekcii roztokom jodidu zošitá vstrebateľnou niťou. Ďalej sa do gluteálnych svalov podáva subkutánne 40 mg enoxaparínu (Clexane) a 5 ml širokospektrálneho antibiotika oxytetracyklínu (Terramycin, Pfitzer Animal Health, Exton, USA). 30
35 sa podáva raz ráno a večer. Ošípaná je transportovaná späť do zvieracieho domu. Dopplerova sonografia: Dopplerovské sonografické vyšetrenia aortoiliakálnych ciev sa vykonávajú intraoperačne (po protézach a po implantácii stentu) a dva a šesť týždňov po implantácii. Maximálny prietok krvi v arteriálnej krvi stehennou kosťou (Fmax, khz) sa stanoví pomocou techniky kontinuálnych vĺn s cieľom posúdiť prietokové vlastnosti distálnej anastomózy. Obr. 9: Dopplerovské sonografické vyšetrenie prietoku krvi vo femure. Počítačová tomografia: Za účelom stanovenia priechodnosti stentu v priebehu času sa po jednej, dvoch vykonajú počítačové tomografické vyšetrenia asistované kontrastnou látkou (Tomoscan AV, Philips Nemecko; Aquileon TSX 101A, Toshiba, Nemecko). štyri a šesť týždňov s použitím zväzku 32
36 renderovacia technika (VRT), ktorá umožňuje súčasné zobrazovanie povrchov a štruktúr, a projekcia maximálnej intenzity (MIP), špeciálna volumetrická vizualizačná technika. Zvieratá sa použili na vyšetrenia ako v 3.3. popísané, sedatívne. Obrázok 10: CT aorto-iliaca oblasť. Oba stenty sú kontinuálne. Veľký šíp: kovový stent, zlomený šíp: PLLA stent (nie rentgenkontrastný) Odber vzoriek a histológia: Aby bolo možné vyhodnotiť vaskulárne a perivaskulárne rezy v oblasti stentu z histomorfologického a planimetrického hľadiska, úseky cievy nesúce stent, ako aj oblasti prechodu k protéze alebo k pôvodná nádoba sa explantovala po období 6 týždňov. 33
38 Úroveň 1: Úroveň 2: Úroveň 3: Proximál anastomózového stentu a protézy Anastomózny šev Distálne od anastomózového stentu a cievy Vzorky ciev sa narezú na hrúbku vrstvy 10 m, zafarbia roztokom hematoxylín/eozín (H.E.) a vysušia. Histoplanimetria: Aby bolo možné morfometricky vyhodnotiť histologické rezy, sú vyfotografované digitálnym kamerovým systémom pre mikroskopy (Axioskop 40, Axio Cam MRc5, Carl Zeiss, Hamburg, Nemecko) a prenesené do PC. Všetky časti sú digitalizované pre planimetrické analýzy a vyhodnotené pomocou softvéru Image J (verzia 1.32j) z webovej stránky národného zdravotníckeho ústavu (. Na hodnotenie post-intervenčnej priechodnosti ciev je priemer zvyškového lúmenu (RL, mm) v úrovniach 1, 2 a 3 v šiestich meraniach, založené na neointimálnej hranici na strane lúmenu, určené pod uhlom 60% a vypočítané z aritmetického priemeru. Neointimálna hyperplázia sa stanoví zo strednej hrúbky intimu (MID, mm), ktorá je nad vzperami na úrovni 3 bolo zmerané, stanovené 35
39 Histomorfológia: Histomorfologické hodnotenie uskutočňujú dvaja nezávislí vyšetrovatelia, ktorí sú slepí voči prítomnosti sirolimu v PLLA stentoch. Skóre poranenia Na semikvantitatívne vyhodnotenie rozsahu poškodenia cievnej steny spôsobeného stentom sa pomocou svetelného mikroskopu vyšetria 4 po sebe idúce rezy distálne od anastomózy a vytvorí sa index poranenia. Posúdi sa každá jednotlivá výstuha rezu a pridelia sa numerické skóre (0 3): 0 neporušená lamina elastica interna (LEI), médium tunica nestlačené, žiadne zranenie 1 neporušené alebo mierne tržné LEI, médium stlačené, nestrčené 2 LEI a tunica media tržná, adventitia neporušená 3 lamina elastica externa (LEE) perforovaná, adventitia poškodená alebo perforovaná. Všetky skóre sa spočítajú a vydelia počtom hodnotených rozpier, aby sa získalo skóre poranenia pre celý stent [48]: Injury Score (IS) = súčet všetkých skóre, počet hodnotených rozpier 36
40 Zápalové skóre Táto klasifikácia skóre sa používa na zaznamenanie rozsahu a hustoty zápalovej reakcie tkaniva po implantácii stentu. Z tohto dôvodu sa každá jednotlivá vzpera semikvantitatívne vyšetruje na prítomnosť zápalových buniek v štyroch po sebe nasledujúcich úsekoch distálne od anastomózy a sú priradené číselné skóre (0 3): 0 žiadne zápalové bunky 1 mierna subintimálna infiltrácia lymfocytov a histiocytov 2 lokálne stredné až husté bunkové agregáty 3 hustá infiltrácia Lymfocyty a histiocyty obklopujúce celú vzperu Zápalové skóre pre celý stent je výsledkom súčtu jednotlivých skóre vydeleného počtom hodnotených vzper [93]. IF = súčet všetkých skóre počet vyhodnotených rozpier 3.8. Štatistické vyhodnotenie: základné parametre operácie a histologické údaje sú uvedené v priemernej odchýlke +/- štandardná odchýlka. Rozdiely sa štatisticky porovnávajú pomocou nepárového dvojstranného T testu. Reprezentácia meraní Dopplerovho ultrazvuku pomocou aritmetického priemeru. Údaje 37
44 Následná dopplerovská sonografia: Po implantácii protézy ukazuje dopplerovská sonografia s kontinuálnymi vlnami pokles amplitúdy systolického prietoku krvi, ktorý je zvrátený implantáciou stentu. Po šiestich týždňoch nedošlo k žiadnemu hemodynamickému poklesu prietoku krvi vo stehennej kosti v skupine kovových a sirolimom potiahnutých PLLA stentov. Naproti tomu došlo k poklesu Fmax v skupine PLLA stentov. Počítačová tomografia: Všetky skupiny so stentom majú otvorený lúmen na počítačovej tomografii po 6 týždňoch. Nepotiahnutá skupina PLLA vykazuje nepravidelnosti, ktoré naznačujú stenózu. Naopak, takmer nerušený arteriálny prietok je možné pozorovať v skupine so Sirolimus PLLA. Hodnotenie lúmenu po stentovaní kovom je problematické, pretože kov produkuje artefakty v počítačovej tomografii. 41
45 Obr.11: CT aortoilikálny. Obidve nohy protézy a AIC sú otvorené (pravý kov, ľavý PLLA). V oblasti stentu PLLA sa vyskytujú nepravidelnosti, ktoré vedú k miernemu zúženiu lúmenu Histologické hodnotenie Všetky segmenty nesúce stent sú kontinuálne, nedochádza k trombotickej oklúzii. Histologické hodnotenie nepreukazuje žiadne známky nadmerného spätného rázu alebo zrútenia stentu. Vo všetkých vzorkách možno nájsť neporušený kruhový rez. 42
46 Obr. 12: Histologický rez ukazujúci dôkaz otvorených kovových (*) a PLLA (**) stentov. Neointimálna hyperplázia je viditeľná nad vzperami stentu (S), ktorá je výraznejšia v PLLA. Zafarbenie HE, pôvodné zväčšenie 12,5 x. Obrázok 13: Histologický rez stentom SIR-PLLA. Nad vzperami stentu (S) je iba minimálna neointimálna hyperplázia. je. Zafarbenie HE, pôvodné zväčšenie 12,5 x. 43
Histologické hodnotenie: všetky stentované segmenty vykazujú otvorený lúmen, v testovacej sérii nedošlo k trombotickej oklúzii. Histologické hodnotenie odhalí neporušený rez kruhového stentu vo všetkých segmentoch, nič nenasvedčuje nadmernému spätnému rázu alebo zrúteniu stentu. Obr. 17: Histologický rez v oblasti ACC, vľavo kov, vpravo PLLA. Je vidieť tvorbu neointimy nad vzperami stentu (S), čo je výraznejšie v PLLA. Zafarbenie HE, pôvodné zväčšenie 12,5 x. 47