Generovanie mutácií in-frame génovej delécie v Pseudomonas aeruginosa a testovanie virulencie

Zhrnutie

Tu popisujeme jednoduchý a reprodukovateľný protokol myšieho modelu infekcie na vyhodnotenie útlmu geneticky modifikovaných kmeňov Pseudomonas aeruginosa v porovnaní s americkým úradom pre kontrolu potravín a liečiv (FDA) schváleným pre komerčné použitie Escherichia coli.

Abstrakt

Úvod

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Pred začatím pokusov na zvieratách musí príslušný protokol schváliť Inštitucionálny výbor pre starostlivosť a použitie zvierat (IACUC). Schválenie opísaného protokolu bolo získané od IACUC na Marshallovej univerzite (Huntington, WV, USA).

  1. Aby ste vytvorili genetickú deléciu pomocou plazmidu pEX100T-NotI, klonujte oblasti DNA lemujúce požadovanú deléčnú sekvenciu a vložte ich do restrikčného miesta NotI plazmidu. Plazmidový inzert by mal obsahovať asi 500 nukleotidov pred cieľovou sekvenciou, ktoré priamo susedia s asi 500 nukleotidmi po cieľovej deletovacej sekvencii. Okrem toho by inzert mal na svojich 5 'a 3' koncoch obsahovať rozpoznávaciu sekvenciu NotI (GCGGCCGC) (obrázok 1B.).

  1. Možnosť 1: použitie tradičných klonovacích techník. Použite PCR na amplifikáciu genómových oblastí pred a za požadovaným génom, potom nasleduje krížená PCR 9, 10 na spojenie s generovanými fragmentmi, štiepenie produktu PCR a plazmidu restrikčnou endonukleázou a ligácia 11 (obrázok 1)B, C).
  2. Možnosť 2: Po navrhnutí delečnej sekvencie in silico tolerujte spoločnosť, ktorá syntetizuje de novo, aby ju inzertovala do plazmidu pEX100T-NotI. Mnoho spoločností zjednodušilo proces klonovania na rýchlu a efektívnu generáciu požadovaného plazmidu. Okrem toho sekvencie pred dodaním kontrolujú, či plazmidy neobsahujú mutácie.

  1. Transformujte elektrokompetentnú E. coli s plazmidom podľa odporúčaní výrobcu. Pomocou sterilnej očkovacej slučky sa 10 ul transformačnej reakcie pre izolované kolónie nanesie na predhriatu agarovú platňu Luria Broth (LB) doplnenú 100 g/ml karbenicilínu a inkubuje sa cez noc pri 37 ° C.
    POZNÁMKA: So všetkým zariadením a médiami používanými na kultiváciu baktérií by sa malo zaobchádzať v súlade s bezpečnostnými pokynmi inštitúcie.
  2. Prejdite dvakrát.
    1. Vyberte doštičku z inkubátora a identifikujte izolovanú kolóniu. Za použitia sterilnej očkovacej slučky sa kolónia vyberie a stripuje sa predhriata LB agarová platňa doplnená 100 g/ml karbenicilínu pre izolované kolónie. Inkubujte cez noc pri 37 ° C. Tento krok opakujte znova, aby ste vytvorili čistú kultúru.
  3. Pomocou sterilnej očkovacej slučky sa naočkuje 5 ml LB jedinou kolóniou z poslednej agarovej platne. Kultúra sa umiestni do trepacieho inkubátora pri teplote 37 ° C cez noc. Nasledujúci deň zmiešajte 1 ml tejto kultúry s 1 ml 5% v kryovej fľaši a uskladnite pri -80 ° C, aby ste vytvorili zamrznutý kmeň odrody.

4. Príprava bakteriálnej distenzie a triparentálna konjugácia

5. Detekcia jednoduchých skrížených rekombinantov P. aeruginosa

6. Detekcia P. aeruginosa dvojnásobná oproti rekombinantom

  1. Pre každú kultivačnú pôdu naočkujte 10 1 kultúry na predhriatu platňu PIA, doplnenú 10% sacharózy (bez glycerolu) a prúžky pre izolované kolónie. Inkubujte platne cez noc pri 37 ° C.
  2. Nasledujúci deň vyberte doštičky z inkubátora a skontrolujte rast. Kolónie rezistentné na sacharózu by mali byť dvojito skríženými rekombinantmi (t. J. Odstrániť plazmid z chromozómu rekombináciou medzi ďalšou homológnou oblasťou plazmidového inzertu a chromozómom P. aeruginosa).
    1. Zahrejte najmenej 20 kolónií so sterilnými špáradlami na predhriatej doštičke: 1) PIA, 2) PIA doplnený 10% sacharózy (bez glycerínu) a 3) PIA doplnený 300 g/ml karbenicilínu.
  3. Inkubujte doštičky cez noc pri 37 ° C.
  4. Vyberte doštičky z inkubátora a skontrolujte ich rast. Skutočné dvojité skrížené rekombinanty budú citlivé na karbenicilín a odolné voči sacharóze (t. J. Kolónie, ktoré rástli na PIA a PIA doplnenom sacharózou, ale nerastli na PIA doplnenom o karbenicilín).

7. Potvrdenie delécie génu pomocou Colony PCR

8. Pripravte bakteriálny kmeň na testovanie na zvieratách

VE2 a PGN5:
aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
aroA R: ATCTGGCTCGATGCCGGTCC

  • Inkubujte kultúry v trepačke v inkubátore pri 160 otáčkach za minútu a 37 ° C, kým nedosiahnu rast logickej fázy (t. J. Meranie OD600 0,4 - 0,6 na spektrofotometri).
  • Pomocou OD600 získaného z dosiahnutej logickej fázy vypočítajte požadovaný objem bujónu, aby ste získali 2,5 x 109 obrazových jednotiek kolónie (CFU) na ml. Peletizujte objem bujónu v 50 ml skúmavkách pri 4 500 x g po dobu 10 minút.
  • Zlikvidujte supernatant a peletu vložte do skúmavky s 50 ml 1x PBS, aby sa bunky umyli. Znovu centrifugujte pri 4 500 x g po dobu 10 minút.
  • Zlikvidujte supernatant a peletu znovu suspendujte v 25 ml 5% odstredeného mlieka v 1x PBS.
    1. Krok overenia: Použite vzorku 25 ml resuspenzie na vykonanie životaschopného počtu doštičiek na stanovenie počtu CFU/ml.
  • Alikvotné podiely 25 ml resuspendovania odstredeného mlieka v 2 ml kultivačných zásob v 2 ml kryovialiek. Flash zmrazte v tekutom dusíku a pred použitím skladujte minimálne cez noc pri -80 ° C.

    • 9. Validácia rastu a kmeňov, ktoré sa uložia na testovanie na zvieratách.

    1. Pre každú testovanú odrodu odstráňte z mrazených zásob najmenej 3 kryoobjemové fľaštičky z -80 ° C a nechajte rozmraziť pri 4 ° C po dobu 2-4 hodín. Ak zostane zamrznutá zásoba, krátko ju zohrejte na 37 ° C.
    2. Z každej kryovej fľaštičky odoberajte malé vzorky na validáciu každej odrody.
      1. Vykonajte počet životaschopných doštičiek, aby ste určili počet CFU/ml. Je normálne, že po zmrazení máte menej CFU/ml v dôsledku smrti niektorých bakteriálnych buniek.
      2. Na validáciu každého kmeňa použite PCR a primery špecifické pre úsek.
      3. Prejdite prstom po každej tlači na selektívnom médiu a overte fenotyp.
    3. Po overení správnosti genotypu a fenotypu kmeňov a po overení obsahu CFU/ml pokračujte k testovaniu na zvieratách.

    10. Očkovanie zvierat bakteriálnymi kmeňmi injekciou

    11. Štatistická analýza úmrtnosti zvierat

    12. Vizualizujte infekciu bioluminiscenciou

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Reprezentatívne výsledky

    Rovnako ako na obrázku 2Ako je ukázané, cielenú genómovú deléciu je možné potvrdiť pomocou kolóniovej PCR so špecifickými primermi, ktoré zosilňujú oblasť záujmu. Kolónie, ktoré nesú genómovú deléciu, majú za následok kratšiu veľkosť pásma PCR v porovnaní s kolóniami divého typu. Na detekciu aspoň jednej kolónie, ktorá nesie cielenú deléciu, je zvyčajne dostatočný PCR screening s 10 až 12 kolóniami. Ak sa mazanie nezistí ani po niekoľkých kolách obrazovky, opakujte postup, ktorý začína konjugáciou. Pokiaľ delécia stále zlyháva, bude pravdepodobne potrebné potvrdiť nasadenie plazmidu sekvenovaním, redizajnom alebo fatálnou sekvenciou. Po overení delécie génu pomocou PCR potvrďte deléciu sekvenovaním. Výsledný kmeň je možné opakovane podrobiť procesu výroby sekvenčných genómových modifikácií.

    Rovnako ako na obrázku 3ako je ukázané, úmrtnosť spojená s intraperitoneálnou injekciou oslabeného kmeňa P. aeruginosa PGN5 (+ mucE) bola 0%, čo bolo rovnaké ako úmrtie pozorované pri E. coli BL21. Na druhej strane, intraperitoneálna injekcia rodičovského kmeňa (VE2) bola smrteľná pre 80% myší. Tieto výsledky sa dosiahli rozsiahlymi krokmi na validáciu injikovaných kmeňov. Aj keď presná príčina smrti u týchto myší nie je známa, je možné ju vysledovať, aspoň čiastočne, expresiou faktorov virulencie v rodičovskom kmeni, ktoré boli z oslabeného kmeňa PGN5 odstránené. Rozdiely v progresii infekcie sa sledovali u rodičov a oslabených kmeňov označených bioluminiscenciou. Oslabený kmeň zostal lokalizovaný v mieste vpichu, kým bioluminiscencia nevybledla (obrázok 4). Klírens infekcie sa s najväčšou pravdepodobnosťou zhodoval s vyblednutím bioluminiscencie. Bioluminiscencia nebola detegovaná 24 hodín po injekcii a myši žili týždne po injekcii, kým neboli usmrtené bez pozorovania vedľajších účinkov.

    generovanie
    Obrázok 2: Gélová elektroforéza produktov PCR na kolóniách z obrazovky delécie aroA na generovanie oslabeného kmeňa P. aeruginosa, PGN5. Produkty PCR pre kolónie prebiehajúce v dráhach 2 - 5 a 8 - 11 ukazujú kolónie s divokým typom aroA. Produkty kolónie PCR prebiehajúce v dráhach 6 a 7 nesú deléciu génov éry, čo je indikované menším produktom PCR (žltá hviezdička). Použité priméry špecificky zosilňovali genómovú oblasť obsahujúcu gén aroA: aroA-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGCUND a aroA-R: ATCTGGCTCGCTCTGCCGGTCC. Očakávaná veľkosť produktu PCR v divokých kolóniách bola 2548 nukleotidov (nt). Očakávaná veľkosť produktu PCR v kolóniách s deléciou aroA bola 307 nt. Rebrík DNA bol vedený v dráhach 1 a 12. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

    in-frame
    Obrázok 3: Celková úmrtnosť myší infikovaných patogénnym kmeňom P. aeruginosa (VE2), oslabeným kmeňom P. aeruginosa (PGN5 + mucE) a kontrolou FDA E. kmeň coli (BL21). Mortalita bola 80% iba u myší, ktorým bol injikovaný patogénny pôvodný kmeň. Zoslabený kmeň P. aeruginosa a kontrola FDA E. kmeň coli mal mortalitu 0%. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

    generovanie
    Obrázok 4: Obrázok myši 3 hodiny po injekcii oslabeného kmeňa P. aeruginosa PGN5 + mucE s bioluminiscenčným markerom. Bioluminiscenčné baktérie boli detegovateľné až 18-24 hodín po injekcii. Počas tejto doby zostala bioluminiscencia v mieste vpichu, čo naznačuje, že baktérie zostali lokalizované v mieste vpichu. Táto myš sa úplne zotavila bez negatívnych účinkov. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    Plazmid pEX100T-Notl je účinným mediátorom postupných genómových delécií, ktoré sú bez markerov a v rámci. Pri vývoji kmeňov baktérií pre oslabenú virulenciu delécia celých génových sekvencií namiesto generovania bodových mutácií znižuje pravdepodobnosť návratu k virulentnému fenotypu. Každá delécia génu patogenity navyše ďalej tlmí patogén a zvyšuje stabilitu tlmenia.

    Túto metódu je možné tiež použiť na vytvorenie iných genómových modifikácií ako delécií, ako sú bodové mutácie a inzercie, jednoduchou zmenou vzoru plazmidového inzertu. Tieto typy modifikácií môžu byť napríklad pre technické baktérie s modifikovaným metabolizmom užitočnejšie ako celé delécie génov. Sekvenčná genómová modifikácia má významný potenciál pre generovanie dizajnových kmeňov baktérií na špecifické účely vo výskume a priemysle. Boli opísané ďalšie spôsoby generovania požadovaných genómových modifikácií bez baktérií bez markerov 15, 16, 17, 18. Rovnako ako u všetkých metód úpravy genómu môžu byť pokusy o modifikáciu základných oblastí genómu fatálne, a preto neúspešné. V týchto prípadoch je na identifikáciu požadovaného bakteriálneho kmeňa potrebná identifikácia rôznych genetických modifikácií alebo iných kandidátskych génov.

    Vzhľadom na početné replikačné udalosti a pasáže každej kolónie v tomto protokole dôjde k neúmyselným zmenám v genóme produkovaného kultivaru. Presné genomické zmeny je možné identifikovať sekvenovaním celého genómu. Účinky týchto zmien sa však dajú určiť ťažšie. Pri vývoji baktérií na konkrétny účel sú prípustné genomické zmeny, ktoré nemajú negatívny vplyv na rast organizmu alebo na cieľové cesty. V závislosti od vytvoreného kmeňa je možné identifikovať „čítanie“, aby sa zabezpečilo, že odroda bude naďalej užitočná na zamýšľaný účel. Napríklad pri PGN5 bolo cieľom vytvoriť oslabenú odrodu, ktorá si zachovala schopnosť produkovať veľké množstvo alginátu. Po delécii piatich génov patogenity sa zmeralo množstvo a zloženie alginátu produkovaného PGN5 a zistilo sa, že je porovnateľné s inými kmeňmi produkujúcimi alginát. Produkcia alginátu nebola ovplyvnená piatimi deléciami génov alebo nechcenými genomickými zmenami, ktoré sa vyskytli počas vývoja PGN5.

    Použitie bioluminiscencie ako markera umožňuje ďalšiu validáciu injikovaných bakteriálnych kmeňov, pretože marker je možné vizualizovať v mieste vpichu. Pre bioluminiscenčné zobrazovanie je potrebné vloženie bioluminiscenčného markera do bakteriálneho chromozómu, ale nemusí to byť možné pri práci s nekompatibilnými kmeňmi/druhmi. Na testovanie útlmu sa však nevyžaduje označovanie kmeňov bioluminiscenciou. Kmene testované v tejto štúdii boli označené bioluminiscenciou, ktorá umožňovala vizualizáciu lokalizačných rozdielov medzi kmeňmi v priebehu infekcie. Pozorovali sme, že patogénny kmeň sa rozšíril telom myši, ale nepatogénny kmeň zostal v mieste vpichu. Aj keď tento experiment testoval iba dva veľmi úzko súvisiace kmene P. aeruginosage, naznačuje, že bakteriálne šírenie je spojené s virulenciou, prinajmenšom v prípade P. aeruginosa. Táto metóda značenia bioluminiscenciou by sa mohla použiť na vizualizáciu vývoja infekcie v budúcnosti, aby sa dalo rýchlo posúdiť útlm technických bakteriálnych kmeňov.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Zverejnenie

    Autor Hongwei D. Yu je hlavný vedecký pracovník a spoluzakladateľ spoločnosti Progenesis Technologies, LLC.