Identifikácia proteínov s aktivitou kinázy - Človek - Potraviny - Životné prostredie
princíp
Pole ľudského fosfo-MAPK a -RTK pole na stanovenie relatívnych hladín fosforylácie aktivovaných mitogénom aktivovaných proteínkináz (MAPK), tyrozínkináz (RTK) a ďalších serín/treonínkináz
Medzi kaskádami intracelulárneho prenosu signálu sa aktivovali kinázy mitogénu
Súprava humánneho fosforo-MAPK na detekciu viacerých fosforylovaných kináz v ošetrených aj neošetrených bunkách.
Rodina proteinkináz (MAPK) hrá ústrednú úlohu. Rodina MAPK kombinuje množstvo serín/treonínkináz, ako napríklad ERK-1 (p44MAPK), ERK-2 (p42MAPK), Jun N-terminálne kinázy a p38-MAPK. Stimulácia bunky napríklad mitogénnymi faktormi zvyčajne vedie k zvýšeniu aktivity MAP kinázy. Napríklad ERK-1 a -2 sa potom translokujú do bunkového jadra a aktivujú transkripčné faktory, čo následne vedie k bunkovej proliferácii alebo diferenciácii buniek, zatiaľ čo inhibícia MAPK tieto procesy inhibuje. Pri konštitutívnej aktivácii týchto kináz môže dôjsť k nekontrolovanému bunkovému rastu, ktorý hrá dôležitú úlohu pri tumorigenéze. Rovnako je zvýšená aktivita ERK spojená so zvýšeným potenciálom nádoru pre invazivitu a metastázy.
Tieto kinázy je možné aktivovať rôznymi receptorovými ligandmi, pričom je dobre charakterizovaný mechanizmus aktivácie ERK1/2 sprostredkovaný receptorovou tyrozínkinázou. Receptorové tyrozínkinázy (RTK) sú dôležitými mediátormi fyziologických bunkových procesov, ako je proliferácia, diferenciácia, motilita alebo regulácia prežitia buniek. RTK zahrnuje receptor pre epidermálny rastový faktor (EGF) a inzulínový receptor. Keď sa ligand receptora viaže na špecifické väzobné miesto RTK, dôjde k zmene konformácie a následnej dimerizácii receptora. To vedie k transfosforylácii dvoch monomérov. Fosforylované tyrozínové zvyšky aktivovaného receptora tvoria miesto ukotvenia pre adaptačné proteíny, ktoré sú potom schopné iniciovať proteínkinázovú kaskádu. Tento princíp možno pozorovať aj pri iných receptorových tyrozínkinázach.
Pomocou poľa humánneho fosfo-MAPK a humánneho fosfo-RTK poľa je možné merať stav fosforylácie veľkého počtu signálnych molekúl, ako aj fosforyláciu receptora v procese signálnej transdukcie. Výhodou týchto polí je veľký počet zaznamenaných MAP kináz a RTK:
Zaznamenaný MAPK (21 MAPK):
ERK1, ERK2, JNK1, JNK2, JNK3, JNK-pan, p38-α, p38-b, p38-g, p38d, RSK1, RSK2, GSK-3a, GSK-3b, Akt1, Akt3, Akt2, Akt pan, MSK1 MSK2, HSP27, p70 S6 kináza
Zachytené RTK (42 RTK):
EGFR, ErbB2, -3, -4, FGFR1, -2a, -3, -4, inzulínR, IGF1-R, Axl, Dtk, Mer, HGFR, MSPR, PDGFRa, -ß, SCFR, Flt-3, MCDFR, c-Ret, ROR1, -2, Tie-1, -2, TekA, -B, -C, VEGFR1, -2, -3, MuSK, Epha1-7, EphB1-6
Princíp merania
Protilátky špecifické pre kinázu sa nanášajú ako dublety na nitrocelulózovú membránu a inkubujú sa s pripraveným bunkovým lyzátom, pričom fosforylované kinázy sa viažu na škvrnité protilátky. Na detekciu sa na každé miesto pipetuje „kokteil“ protilátok proti 21 špecifickým kinázam, na konci ktorého je spojený biotín. Pre každú škvrnu sa vytvorí viacvrstvová vrstva imobilizovaných protilátok, kinázy a komplexu protilátka-biotín vo forme „molekulárneho sendviča“. Skutočná detekčná reakcia potom prebieha pridaním streptavidínu-HRP a detekciou chemiluminiscencie.
Skúšobné hodnotenie
Bunky boli ošetrené substrátom počas 15 minút alebo boli ponechané neošetrené. Po príprave a inkubácii bunkového lyzátu s protilátkami sa deteguje pomocou chemiluminiscencie. Digitalizované obrázky sa potom denzitometricky vyhodnotia a intenzita pixelov sa zobrazí graficky.
náklady
Cca 380 EUR za 4 vzorky na súčasné stanovenie 21 MAPK
Cca 450 € za 4 vzorky na súčasné stanovenie 42 RTK
Príklad aplikácie (všeobecne)
Regulačný vplyv zložiek potravín na fosforyláciu signálnych proteínov alebo receptorov v kontexte imunitnej odpovede (Wang et al. 2007 a Stehphen et al. 2007), ako aj vplyv mliečnych oligosacharidov na procesy signálneho prevodníka (Kuntz et al. 2009).