IgG - ttg - Imunitná odpoveď na cukrovku typu 1 s celiakiou - PDF na stiahnutie zadarmo
Fakultná nemocnica Ulm Centrum interných chorôb Klinika interných chorôb I Lekársky riaditeľ: Prof. Dr. Guido Adler Zameranie na endokrinológiu, cukrovku a metabolizmus Prof. Dr. med. Bernhard O. Böhm IgG - ttg - imunitná odpoveď pri cukrovke 1. typu s celiakiou Dizertačnú prácu pre získanie doktorského titulu v odbore zubné lekárstvo na Lekárskej fakulte Univerzity v Ulme predniesol Timo Knoche Böblingen 2010 I
Poverený dekan: prof. Dr. Klaus-Michael Debatin, prvý spravodajca: prof. Dr. Bernhard Otto Böhm 2. reportér: Prof. Dr. Peter Kern PhD deň: 22. apríla 2010 II
Obsah Zoznam skratiek 1. Úvod 1 1.1 Definícia celiakie 1 1.2 História 2 1.3 Epidemiológia a patogenéza celiakie 4 1.4 Formy celiakie 8 1.5 Celiakia a iné choroby 12 1.6 Vydanie 16 2. Materiál a metódy 17 2.1 Činidlá, roztoky a pufre 17 2.2 Zariadenia a spotrebný materiál 19 2.3 Séra pacientov 20 2.4 Stanovenie titra 21 2.4.1 Stanovenie titra ttg-iga 21 2.4.2 Stanovenie titra ttg-igg 29 3. Výsledky 30 3.1 Stanovenie titra ttg-iga 30 3.2 Stanovenie titra ttg-igg 32 3.3 Priame porovnanie titrov ttg-igg a ttg-iga 34 3.4 Výpočtové porovnanie titrov/štatistické výsledky 38 IV
4. Diskusia 43 5. Zhrnutie 52 6. Bibliografia 53 Príloha V
Zoznam skratiek AGA Protilátky proti gliadínu APC antigény prezentujúce bunkové BSA hovädzie sérum albumín CD zhluk diferenciácie DR, lokusy génu HLA na chromozóme 6 DZG Deutsche Zöliakie Gesellschaft e.v. Test ELISA spojený s enzýmom Imunosorbent EmA Endomysium Protilátky ESPGHAN Európska spoločnosť pre pediatrickú gastroenterológiu, hepatológiu a výživu GFD Bezlepková diéta, Bezlepková diéta Kyselina bezvodá H 2 SO 4 Kyselina sírová HLA Ľudské leukocytové antigény IFN Interferóny IgA Imunoglobulín Imunoglobulín Typ A Imunoglobulín typu G IgM typu M IL Interleukín MHC Hlavná histokompabilita Komplex ml Mililitre MMP Matrix metaloproteinázy mrna messenger Ribonukleová kyselina PBS Fosfátom pufrovaný soľný roztok TGF Rastový faktor nádoru TMB Tetrametylbenzidín TNF Nádor Nekróza Faktor ttg Tkanivo Akútna transglutáza Tkanivo Akútna transglutáza Tkanivo Akútna transglutáza; svojvoľná, svojvoľná jednotka VI
- Kontrolná biopsia indikovaná v prípade pochybného klinického úspechu s bezlepkovou diétou - Expozícia gluténu biopsiou uvedená v: - Pochybnosti o počiatočnej diagnóze - Diagnóza vo veku 30/100 epiteliálnych buniek) a normálna slizničná architektúra, hyperplastický typ II, s hyperpláziou krypt, zvýšenými intraepiteliálnymi lymfocytmi a normálnymi klkami a deštruktívny typ III s 3 podtypmi a až c, ktorý vykazuje plné alebo sploštenie klkov, hyperpláziu krypty, zvýšené intraepiteliálne lymfocyty a zápalový infiltrát v lamina propria (DZG 2009). 11
Protilátky endomýzia v normálnom rozmedzí a tiež Dudenalova biopsia ukazujú nenápadný obraz. Pacienti so selektívnym nedostatkom IgA majú 10-krát vyššie riziko vzniku celiakie. Sjogrenov syndróm, vypadávanie vlasov a Addisonova choroba sú ďalšie poruchy, ktoré môžu súvisieť s celiakiou. Riziko lymfómu v tenkom čreve je najväčšie u pacientov, ktorým je v dospelosti diagnostikovaná celiakia. Rakovina hltana a pažeráka sa tiež môže vyskytnúť častejšie u pacientov s celiakiou. Posledné štúdie z roku 2004 však ukazujú, že existuje len mierne zvýšené riziko nádoru a že dodržiavanie prísnej GFD vedie k úprave rizika pre bežnú populáciu v priebehu 5 - 10 rokov (Mäki a Collin 1997, DZG 2009). 15
1.6 Problém Zavedením sérologickej diagnostiky a objavením protilátok sa prevalencia rýchlo zvýšila. Ukázalo sa, že pacienti s celiakiou zaznamenaní biopsiou boli iba špičkou ľadovca. Nevýhodou tkanivových testov, endomýziových a retikulínových testov sú vysoké náklady a obmedzený prísun substrátu, ktorý je potrebné získať z opičieho pažeráka. Na vykonanie týchto skúšok je navyše potrebný špeciálne vyškolený personál, pretože skúšky sú technicky veľmi zložité. (Mäki a Collin 1997). Po identifikácii antigénu ttg bolo možné vyvinúť špecifické testovacie súpravy na kvantitatívnu detekciu protilátok. Testy ako Elisa nielen uľahčili počiatočnú diagnózu, ale aj následnú a kontrolnú diagnostiku. Bežné testy používajú antigén ttg na detekciu protilátok IgA a IgG. Táto práca sa zamerala na distribúciu IgA a IgG anti-tTG-Ab v kontexte cukrovky 1. typu. Cieľom je skontrolovať, či výsledky umožňujú vyvodiť závery o imunologickom procese a či to môže zlepšiť diagnostiku. 16
2. Materiál a metódy 2.1 Reagencie, roztoky a pufre Celikey IgG PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Germany) GmbH) Tkanivová transglutamináza (ľudská, rekombinantná) IgG protilátka Stanovenie pre diagnostiku in vitro Mikrotitračné prúžky (17996) potiahnuté ľudským, rekombinantným ttg antigénom 6 ttg ( IgG) štandardné roztoky protilátok v koncentráciách 0 3 7 16 40 - 100 U/ml v PBS s BSA 0,095% (hm./obj.) Azid sodný 1 pozitívna kontrola s BSA, 0,095% (hm./obj.) Azid sodný, detergent a ľudské sérum v PBS 1 negatívna kontrola s BSA, 0,095% (hmotn./obj.) Azid sodný, detergent a ľudské sérum v PBS koncentráte premývacieho pufru 20x PBS koncentrát s 0,095% (hmotn./obj.) Azid sodný a pufor na čistenie vzoriek detergentu s BSA, 0,095% (hmotn./obj.) a prací prostriedok, zafarbený žltý konjugát IgG, antihumánna peroxidáza IgG, zafarbený červený Enzýmový substrát TMB (3, 3, 5, 5, tetrametylbenzidín) zastavovací roztok, 0,5 MH 2 SO 4, bezfarebný 17
Celikey PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Germany) GmbH) Tkanivová transglutamináza (ľudská, rekombinantná) IgA protilátka Test na in vitro diagnostiku 7-16-40-100 U/ml v PBS s BSA 0,095% (hm./obj.) Pozitívny azid sodný 1 s BSA, 0,095% (hm./obj.) Azid sodný, detergent a ľudské sérum v PBS 1 negatívna kontrola s BSA, 0,095% (hmotn./obj.) Azid sodný, detergent a ľudské sérum v PBS koncentráte premývacieho pufru 20x koncentrát PBS s 0,095% (hmotn./obj.) Azidu sodného a detergentu Vzorkový pufor s BSA, 0,095% (hmotn./obj.) Azid sodný a detergent, zafarbený žltý IgA konjugát, Antihumánna IgA peroxidáza, zafarbený červený enzýmový substrát TMB (3, 3, 5, 5, tetrametylbenzidín) zastavovací roztok, 0,5 MH 2 SO 4, bezfarebný 18
2.2 Prístroje a spotrebný materiál Eppendorf Hamburg - Referencia pipety - Multipipette Multipette plus - Combitipp 1,0 ml, 2,5 ml, 5,0 ml Sarstedt Nümbrecht - Pipetové špičky žlté 10 100 µl - Pipetové špičky modré 100 1000 µl Vortex - Shaker Genie Ampuwa - Destilovaná Water SLT - prístroj na meranie mikrotitračnej doštičky Spectra Epson - tlačiareň LX-400 Ostatné - konvenčný osobný počítač, MS Word 2003, MS Excel 2003 - Synelisa Software Ver. 3.2. Júl 1995 - Štatistické programy Winstat a PASW Statistics 18 19
2.3 Séra pacientov Boli použité séra pacientov, pre ktoré už boli k dispozícii titre IgA. Vybrali sa tie séra, ktoré mali titer IgA vyšší ako 8 U/ml, aby sa zabránilo hraničným pozitívnym sérom (šedá oblasť). Z populácie 803 pacientov s diabetom 1. typu bolo na stanovenie titrov IgA a IgG vybraných 73 sérom pozitívnych IgA od 44 pacientok a 26 mužov. Pohlavie nebolo možné priradiť v 3 vzorkách. Vek pacientov sa pohybuje od 4 do 84 rokov. 25 pacientov malo titer IgA vyšší ako 100 U/ml. Séra týchto pacientov sa ďalej skúmali s príslušnými riedeniami, aby sa kvantifikovali titre protilátok. Tabuľka 1: Prehľad populácie, N = počet Počet vekových skupín N Muž Žena Neznámy Rozsah Štúdia 1 59 20 38 1 4 84 Štúdia 2 14 6 6 2 11 83 20
23 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Obrázok 2: Štandardy pipetovacej schémy: čierne kontroly: biele +/- pacienti: biele, očíslované
2.4.1.3 Grafické znázornenie postupu testu = ľudský rekombinantný tkanivový transglutaminázový antigén ako pevná fáza Obrázok 3: Schematické nastavenie testu 1 z 10 pipetovania vzoriek séra = protilátka tkanivovej transglutaminázy, = ľudský, rekombinantný tkanivový transglutaminázový antigén ako pevná fáza = ďalšie zložky bunky Obrázok 4: Schematické nastavenie testu 2 z 10 24
= Tkanivová transglutaminázová protilátka, = ľudský, rekombinantný tkanivový transglutaminázový antigén ako pevná fáza = ďalšie zložky bunky 1. reakcia: Protilátky proti tkanivovej transglutamináze prítomné v sére pacienta sa viažu na antigény. Inkubujte 30 minút. Obrázok 5: Schéma usporiadania experimentu 3 z 10 3 x vyplachovanie z dutiny premývacím pufrom = tkanivová transglutamináza Protilátky = ľudský rekombinantný tkanivový transglutaminázový antigén ako pevná fáza = ďalšie bunkové komponenty Obrázok 6: Schematické nastavenie testu 4 z 10 25
Pipetovanie do konjugátu anti-ľudská peroxidáza = konjugát anti-ľudskej peroxidázy = tkanivová transglutaminázová protilátka = ľudský rekombinantný tkanivový transglutaminázový antigén ako pevná fáza Obrázok 7: Schéma usporiadania experimentu 5 z 10 = anti-ľudská peroxidázová konjugát = tkanivová transglutaminázová protilátka = ľudská tkanivová transglutamináza, rekombinantná ako 2. fáza na tuhej fáze: konjugát sa kombinuje s komplexom antigén-protilátka. Inkubujte 30 minút Obrázok 8: Schéma experimentálneho usporiadania 6 z 10 26
3 x vymytie z dutiny premývacím pufrom = konjugát anti-ľudská peroxidáza = tkanivová transglutaminázová protilátka = ľudský, rekombinantný tkanivový transglutaminázový antigén ako pevná fáza Obrázok 9: Schematické experimentálne nastavenie 7 z 10 TMB pipetovanie do enzýmového substrátu tetrametylbenzidín = konjugovaná anti-ľudská transglutamináza = ľudská peroxidáza = tkanivo, rekombinantný tkanivový transglutaminázový antigén ako pevná fáza = tetrametylbenzidín Obrázok 10: Schematické experimentálne nastavenie 8 z 10, TMB = tetrametylbenzidín 27
= Konjugát anti-ľudskej peroxidázy = tkanivová transglutaminázová protilátka = ľudský, rekombinantný tkanivový transglutaminázový antigén ako pevná fáza = tetrametylbenzidín inkubujte 10 minút v tme Pevná fáza = tetrametylbenzidín H2S04 = tetrametylbenzidín po zmene farby 3. reakcia: - Komplexy konjugátu a protilátky s antigénom značené enzýmom nastavili substrát tak, aby zmenil farbu substrátu z červenej na žltú - reakcia sa zastaví kyselinou sírovou - 30 minút po zastavení môže byť fotometrická optické hustoty sa určujú pri 450 nm Obrázok 12: Schematické nastavenie skúšky z 10, H2S04 = kyselina sírová 28
Tabuľka 2: Kolmogorov-Smirnovov test na normálne rozdelenie s korekciou významnosti podľa Lilliefors pre ttg (iga) a ln [ttg (iga)], ttg (iga) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze, ln = logaritmus k báze e, n = počet Kolmogorov-Smirnov n Význam ttg (iga) 73 000 ln [ttg (iga)] 73,032 Obrázok 13: Histogram hodnôt absolútneho titra ttg (iga) s krivkou normálnej distribúcie, ttg (iga) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze Obrázok 14: Histogram logaritmickej hodnoty Hodnoty titra pre bázu e ttg (iga) s krivkou normálneho rozdelenia, ln = logaritmus pre bázu e, ttg (iga) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze 31
Obrázok 15: Histogram absolútnych hodnôt titra ttg (igg) s krivkou normálnej distribúcie, ttg (igg) = protilátky typu G proti tkanivovej transglutamináze Obrázok 16: Histogram hodnôt logaritmizovaného titra pre bázu e ttg (igg) s krivkou normálnej distribúcie, ln = logaritmus k báze e, ttg (igg) = protilátka typu G proti tkanivovej transglutamináze 33
3.3 Priame porovnanie titrov ttg-igg a ttg-iga Pri priamom porovnaní výsledkov stanovenia titrov ttg-iga a ttg-igg a komparatívneho grafického znázornenia titrov testovaných osôb je zrejmé: 93% (69 zo 73) vzoriek má Titer IgA vyšší ako titer IgG; u 7% z nich (5 zo 69) je hodnota významne vyššia ako hodnota IgG (pozri obrázok 17-24). V 7% (5 zo 73) vzoriek je však titer IgG vyšší ako titer IgA (pozri obrázok 17-24). Pri pohľade na porovnanie stĺpcových grafov IgA a IgG je možné pozorovať nasledovné: Hodnoty IgA a IgG navzájom nekorelujú, t. H. vysoký titer ttg-iga nevedie k vysokému titru ttg-igg. - Rovnako tak nízky titer IgA nie je spojený s nízkym titrom IgG a naopak. - Ak je naopak vysoký titer IgG, potom existuje aj vysoký titer IgA. titer IgG-IgG ttg v porovnaní 900 800 700 600 500 titer 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 počet vzoriek ttg (IgA) ttg (IgG) Obrázok 17: titer IgG-IgG ttg v porovnaní, číslo vzorky 1 -10, ttg (IgA) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze, ttg (IgG) = protilátky typu G proti tkanivovej transglutamináze 34
Porovnávací titer ttg IgA-IgG 400 350 300 250 titer 200 150 100 50 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Počet vzoriek ttg (IgA) ttg (IgG) Obrázok 18: Porovnávací titer ttg IgA-IgG, číslo vzorky 11- 20, ttg (IgA) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze, ttg (IgG) = protilátky typu G proti tkanivovej transglutamináze ttg IgA-IgG titer v porovnaní s 500 450 400 350 300 titer 250 200 150 100 50 0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Počet vzoriek ttg (IgA) ttg (IgG) Obrázok 19: porovnanie titra ttg IgA-IgG, číslo vzorky 21-30, ttg (IgA) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze, ttg (IgG) = protilátky typu G proti tkanivovej transglutamináze ttg titer IgA-IgG v porovnaní 1 000 900 800 700 600 titer 500 400 300 200 100 0 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 počet vzoriek ttg (IgA) ttg (IgG) Obrázok 20: titer ttg IgA-IgG v porovnaní, Číslo vzorky 31-40, ttg (IgA) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze, ttg (IgG) = protilátky typu G proti tkanivovej transglutamináze 35
titer ttg IgA-IgG v porovnaní 300 250 200 titer 150 100 ttg (IgA) ttg (IgG) 50 0 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 číslo vzorky Obrázok 21: titer ttg IgA-IgG v porovnaní, číslo vzorky 41-50, ttg (IgA) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze, ttg (IgG) = protilátky typu G proti tkanivovej transglutamináze, titer ttg IgA-IgG v porovnaní 1400 1200 1000 titer 800 600 400 200 0 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 číslo vzorky ttg (IgA) ttg (IgG) Obrázok 22: titer ttg IgA-IgG v porovnaní, počet vzoriek 51-60, ttg (IgA) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze, ttg (IgG) = protilátky typu G proti tkanivovej transglutamináze ttg IgA- Porovnávací titer IgG 400 350 300 250 titer 200 150 100 50 0 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 počet vzoriek ttg (IgA) ttg (IgG) Obrázok 23: Porovnávací titer ttg IgA-IgG, počet vzoriek 61-70, ttg (IgA) = protilátky typu A proti tkanivovej transglutamináze, ttg (IgG) = protilátky typu G proti tkanivovej transglutamináze 36