Imunitná regulácia slizničnými regulačnými Foxp3 pozitívnymi T bunkami u detí a dospievajúcich
Imunitná regulácia prostredníctvom slizničnej regulácie Foxp3 pozitívne T bunky u detí a dospievajúcich s celiakiou Dizertačná práca pre akademický titul Dr. med. na Lekárskej fakulte Lipskej univerzity predložil: Michael Bauch narodený 24. apríla 1986 v Karl-Marx-Stadt vyrobený na Klinike a poliklinike pre deti a dorast Univerzity v Lipsku Vedúci: PD Dr. med. habil. Holm H. Uhlig Rozhodnutie o udelení doktorského titulu od: 18.09.2012
Obsah Obsah Bibliografický popis. 2 Obsah. 3 Zoznam skratiek. 5 1. Úvod. 6 1.1 Celiakia. 6 1.1.1 Epidemiológia. 6 1.1.2 Etiopatogenéza. 6 1.1.3 Diagnostika. 10 1.1.4 Terapia. 11 1.1.4.1 Bezlepková diéta. 11 1.1.4.2 Stratégie experimentálnej terapie. 11 1.2 Regulačné T bunky. 12 1.2.1 Typy regulačných T buniek. 13 1.2.2 Supresné mechanizmy CD4 + CD25 + Foxp3 + regulačných T buniek. 14 1.3 Cieľ práce. 17 2. Materiál a metódy. 19 2.1 Etické hlasovanie. 19 2.2 Priebeh štúdia. 19 2.3 Nábor študovanej populácie. 20 2.3.1 Skupina pacientov s celiakiou. 22 2.3.2 Kontrolná skupina. 22 2.4 Telefonický rozhovor Zber anamnestických údajov. 23 2.5 Antropometrické údaje. 23 2.6 Klinická chémia. 24 2.7 Protilátky špecifické pre celiakiu. 24 2.8 Farbenie histologických rezov. 25 2.8.1 Príprava vzoriek tkaniva. 25 2.8.2 Farbenie hematoxylínom-eozínom (HE). 25 2.8.3 Imunohistochemické farbenie. 26 2.8.4 Imunofluorescenčné farbenie. 27 2.8.5 Mikroskopia a fotografia. 28 2.9 Morfometrické meranie histologických rezov. 28 2.9.1 Meranie klkov a krypt. 28 3
Zoznam skratiek Zoznam skratiek BMI Index telesnej hmotnosti CD Zhluk diferenciácie CTLA-4 Cytotoxický antigén asociovaný s lymfocytmi 4 Cy5 Kyanín 5 DAB 3,3-Diaminobenzidín DAPI 4,6-Diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid FITC Fluoresceín tiokyanát Foxp3 Forkhead Box Protein 3 Fúzny peptid HA hypoalergén HE hematoxylín a eozín HLA ľudský leukocytový antigén HRP chrenová peroxidáza chrenová peroxidáza IDO indolamín-2,3-dioxygenáza IEL intraepiteliálne lymfocyty IgA/IgG imunoglobulín A alebo imunoglobulín G, IL IP interferón-poly-interpulín, poly-interferón-dysopatický, poly-interferón-dysopatický enteropatia X-viazaný syndróm LAG-3 lymfocytový antigén 3 MCV stredný korpuskulárny objem (priemerný objem erytrocytov) MHC hlavný komplex histokompability MICA MHC s triedou I súvisiaca s polypeptidom A matica MMP metaloproteinázy NKG2D receptor prirodzených zabíjačských buniek PBST fosfátom pufrovaný soľný roztok s Tween-20 Referenčné jednotky SDS Standard Dev iačné skóre TBS Tris pufrovaný soľný roztok TGF-p transformujúci rastový faktor beta Th pomocná bunka (CD4 + CD3 + T bunky) TNFα tumor nekrotizujúci faktor alfa 5
1. Úvod Cieľom tejto štúdie je preskúmať nasledujúce témy: 1. Skupinu detí a dospievajúcich s celiakiou je potrebné charakterizovať klinicky, paraklinicky, anamnesticky a histologicky. Konkrétne sa porovnávajú bunkové a humorálne imunitné markery medzi skupinou pacientov s celiakiou a skupinou pacientov bez celiakie. 2. Jedným z cieľov je detekcia a kvantifikácia regulačných T buniek Foxp3 + v sliznici tenkého čreva u detí a dospievajúcich s celiakiou a kontroly bez vilóznej atrofie. 3. Cieľom je preskúmať, či počet slizničných regulačných T buniek Foxp3 + v mieste zápalu koreluje s anamnestickými, antropometrickými, sérologickými, hematologickými a histologickými markermi u pacientov s celiakiou. Skúmať sa má predovšetkým veková závislosť a možné rodové rozdiely v regulačných T bunkách. 18
2. Materiál a metódy S cieľom zhromaždiť anamnestické údaje sa pri prvom kontakte s rodičmi uskutočnil krátky rozhovor. Len čo bol získaný písomný súhlas, boli z Ústavu patológie vyžiadané archivované vzorky tkaniva tenkého čreva. Zároveň boli spätne zaznamenané antropometrické, klinické, paraklinické a sérologické údaje o každom pacientovi v čase endoskopie. Po odovzdaní tkanivových vzoriek boli vzorky narezané, histologicky zafarbené a vyhodnotené. Všetky zaznamenané parametre boli zadané do databázy Excel (obrázok 2.1). Obrázok 2.1 Prehľad praktického priebehu štúdie. 2.3 Nábor študovanej populácie Spočiatku sa nadviazali kontakty s rodičmi 195 detí a dospievajúcich. Celiakia bola diagnostikovaná u 63 z týchto pacientov. Celiakia bola vylúčená biopsiou u 132 pacientov. Iba 17 rodičov (8,7%) po prvom kontakte odmietlo účasť na štúdii. Pre konečnú účasť písomný súhlas 20