Inhibícia konexínových hemikanálov zmierňuje steatohepatitídu bez alkoholu u myší

predmetov

abstraktné

úvod

Nealkoholické tukové ochorenie pečene (NAFLD) je najbežnejším chronickým ochorením pečene s odhadovanou prevalenciou na celom svete 25% 1. NAFLD predstavuje spektrum chorôb od steatózy pečene po steatohepatitídu bez alkoholu (NASH), fibrózu pečene, cirhózu pečene a nakoniec hepatocelulárny karcinóm 2. Steatóza pečene môže byť spôsobená zvýšeným prítokom mastných kyselín z diéty s vysokým obsahom tukov, inzulínovou rezistenciou, liekmi a genetickými faktormi. Steatózu ako takú charakterizuje akumulácia lipidových kvapiek na báze triglyceridov v cytosole hepatocytov 3. Steatóza pečene sa môže vyvinúť na NASH v reakcii na množstvo spúšťačov, ako sú zápalové cytokíny, adipokíny, reaktívne formy kyslíka a stres endoplazmatického retikula 4 .

Výsledky

Účinky TAT-Gap24 a TAT-Gap19 na aktivitu spojenia medzery a odozvy konexínového hemikanála

TAT-Gap24 a TAT-Gap19 napodobňujú aminokyselinovú sekvenciu v oblasti intracelulárnej slučky Cx32, respektíve Cx43. Zistilo sa, že Gap19 sa viaže na C-koncovú oblasť Cx43, čím porušuje interakciu medzi intracelulárnou slučkou a C-koncovou oblasťou, čo zase inhibuje otvor 12 hemikanálu Cx43. Predpokladá sa, že podobný mechanizmus je základom pôsobenia TAT-Gap24 na hemikanály Cx32. Na vyhodnotenie špecifičnosti TAT-Gap24 a TAT-Gap19 na blokovanie hemikanálov Cx, ale nie na medzery, sa uskutočnila obnova fluorescencie po analýze fotobielením (FRAP) v kultúrach potkaních hepatocytov (n = 4, N = 4). . Konkrétne boli potkanie hepatocyty vystavené 24 hodín po nanesení na platňu 20 uM TAT-Gap19, 20 uM TAT-Gap24, 50 uM karbenoxolónu (CBX), známemu inhibítoru Cx kanálov 17 alebo kontrole vehikula po dobu 24 hodín a 48 hodín. Keď sa použili s 20 μM, TAT-Gap24 a TAT-Gap19 neindukovali žiadnu cytotoxicitu v hepatocytových kultúrach primárneho potkana (doplnkový 1). CBX znížil regeneráciu fluorescencie po 24 hodinách (str

konexínových

konexínových

Účinky TAT-Gap24 a TAT-Gap19 na expresiu konexínového proteínu v pečeni. Po 8 týždňoch CHFD bola chirurgicky implantovaná osmotická pumpa do brušnej dutiny, čím bolo zaistené trvalé uvoľňovanie 1 mg/kg/deň TAT-Gap24 (n = 11) alebo TAT-Gap19 (n = 12) alebo fyziologického roztoku (n =) 14 ) ďalšie 2 týždne, kým diéta pokračuje. Imunoblotová analýza Cx26 (21 kDa), Cx32 (27 kDa) a Cx43 (43 kDa) po separácii a blotovaní, po ktorých sa výsledky normalizovali na celkovú proteínovú záťaž. Oprava obrázkov je orezaná. Bloty po celej dĺžke sú zobrazené v doplnku 4. Údaje sú vyjadrené ako priemery ± SEM.

Účinky TAT-Gap24 a TAT-Gap19 na biometrické parametre, histológiu pečene a sérové ​​transaminázy

Relatívna hmotnosť tuku sa viac ako zdvojnásobila a bola u myší kŕmených CHFD (n = 14) v porovnaní s myšami kŕmenými ND (p 22. Všetky skóre boli 0 v skupine kŕmenej ND (n = 10) a bola tu jedna Zvýšenie skóre steatózy (str

steatohepatitídu

Účinky TAT-Gap24 a TAT-Gap19 na biometrické parametre a histológiu pečene v NASH. Po 8 týždňoch CHFD bola chirurgicky implantovaná osmotická pumpa do brušnej dutiny, čím bolo zaistené trvalé uvoľňovanie 1 mg/kg/deň TAT-Gap24 (n = 11) alebo TAT-Gap19 (n = 12) alebo fyziologického roztoku (n =) 14 ) počas ďalších 2 týždňov pokračujte v diéte. a ) Telo, tuk a pečeň myší a relatívna hmotnosť pečene a tukov. ( ) Steatóza, lobulárny zápal, tvorba balónikov a skóre NAS na základe farbenia pečeňového tkaniva hematoxylínom-eozínom skupiny ND (prvý panel), soľného roztoku (druhý panel), TAT-Gap24 (tretí panel) a TAT-Gap19 skupiny (štvrtý Panel) panel). Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM s * p

inhibícia

Účinky TAT-Gap24 a TAT-Gap19 na zápalové cytokíny a oxidačný stres v NASH. Po 8 týždňoch CHFD bola chirurgicky implantovaná osmotická pumpa do brušnej dutiny, ktorá zabezpečila trvalé uvoľňovanie TAT-Gap24 (n = 11) alebo TAT-Gap19 (n = 12) alebo soľného roztoku (n =) 14 mg/kg/deň ) počas ďalších 2 týždňov pokračujte v diéte. ( a ) Hladiny IFN-y, IL-6, IL-lp, TNF-a a IL-10 v pečeňovom tkanive a sére. ( ) Aktivita SOD, GR, GPx a katalázy v tkanive pečene. Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM s * p27. To platí aj pre glutatión reduktázu (GR), glutatiónperoxidázu (GPx) a katalázu ako antioxidačné enzýmy 28. V skutočnosti mali myši a ľudia s NASH zníženú hladinu aktivity glutatiónu, SOD a katalázy 27, 29. Je zaujímavé, že v pečeni myší kŕmených CHFD (n = 14) boli zistené vyššie GPx (p 30,). Podobné účinky (p 31. Pre lymfocytový antigén (LY) 86 neboli zistené žiadne rozdiely na úrovni proteínu. (6 a ďalších 5).

konexínových

2, 5 ul M12 sa viaže, čo umožňuje peptid zachytiť a zadržať intracelulárne. Predpokladá sa, že Gap24 reaguje podobne ako Cx32 18. U myší NASH liečených TAT-Gap24 aj TAT-Gap19 došlo k zníženiu hladín triglyceridov, cholesterolu, IL-ip a vyšších množstiev SOD v pečeňovom tkanive. Okrem toho TAT-Gap19 tiež znižoval hladiny ALT a TNF-a, zatiaľ čo myši liečené TAT-Gap24 mali nižšie hladiny IFN-y. - a mal hladiny IL-6. Je však potrebné zdôrazniť, že z tejto štúdie nemožno úplne vylúčiť nešpecifické účinky ako také z dôvodu chýbajúcej kontroly peptidu miešaného vajíčka. Úrovne aktivity SOD, katalázy, GR a GPx sa zvyčajne znižujú počas NASH 27, 29, pretože nadmerne produkované reaktívne formy kyslíka môžu priamo rozkladať antioxidačné molekuly a inhibovať aktivity antioxidačných enzýmov 44. Pretože kataláza, GPx a SOD vyvíjajú svoju enzymatickú aktivitu v tesnom vzájomnom vzťahu 44, pokles aktivity katalázy a GPx by mohol odrážať kompenzačný mechanizmus pre zvýšené hladiny aktivity SOD.

Stručne povedané, inhibícia hemikanálov Cx môže otvoriť perspektívu pre zavedenie nových terapeutických stratégií pre liečbu NASH.

Materiály a metódy

Zvieratá a liečba

Izolácia a kultivácia hepatocytov

Samce potkanov Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Belgicko) boli chované za kontrolovaných podmienok prostredia s voľným prístupom k potrave a vode. Hepatocyty sa izolovali pomocou dvojstupňového postupu perfúzie kolagenázy, vrátane purifikácie sériovou diferenciálnou centrifugáciou, a životaschopnosť buniek sa hodnotila vylúčením trypánovej modrej. Životaschopné (≥ 85%) hepatocyty s hustotou 0,56 × 105 buniek na cm 2 vo Williamovom médiu E (Invitrogen, USA), doplnené 7 ng/ml glukagónu, 292 mg/ml L-glutamínu, antibiotiká ( 7, 33 IU), naočkovaný benzylpenicilín sodný, 50 ug/ml kanamycínmonosulfátu, 10 ug/ml amficilínu sodného a 50 ug/ml streptomycínsulfátu) a 10% fetálne hovädzie sérum. Po 4 hodinách, 24 hodinách a 48 hodinách sa bunkové kultivačné médium odstránilo a nahradilo sa médiom bez séra obsahujúcim 25 μl. g/ml hydrokortizónu hemisukcinátu sodného a 0,5. g/ml inzulínu. Postupy ustajnenia potkanov, ako aj izolácia a kultivácia hepatocytov boli schválené Etickou komisiou pre experimenty na zvieratách Vrije Universiteit Brussel (projekt číslo 14-210-1) a všetky zvieratá boli testované podľa kritérií Príručky pre starostlivosť a použitie laboratórnych zvierat. „.

Obnova fluorescencie po fotobielení

Pre FRAP analýzu 24 hodín po nanesení buniek boli kultivované potkanie hepatocyty vystavené pôsobeniu 50 uM CBX, 20 uM TAT-Gap24, 20 uM TAT-Gap19 alebo kontrole vehikulom na 30 minút, 24 hodín a 48 hodín. FRAP analýza sa uskutočňovala tak, ako už bolo opísané 37. Fluorescencia v bielených bunkách bola vyjadrená ako percentuálna výťažnosť vzhľadom na základnú hladinu bezprostredne pred fotobielením. Podobná analýza sa uskutočňovala na bunkách odstránených z bielenej oblasti na sledovanie fotobielenia mimo cieľovej oblasti. Hodnoty výťažnosti pre každý experiment sa normalizovali na príslušné podmienky kontroly vehikula. Ďalej sa po prispôsobení nelineárnej krivky vypočítali hodnoty Yo, plató, tau, polčasu a mobilnej frakcie.

Meranie extracelulárneho adenozíntrifosfátu

Extracelulárne uvoľňovaný ATP sa meral pomocou komerčnej súpravy na luciferín/luciferázový test (Sigma, USA), ako už bolo opísané vyššie 37. TAT-Gap24 a TAT-Gap19 sa najskôr inkubovali pri 37 ° C počas 0 minút, 6 dní alebo 20 dní v klasickom inkubátore (Galaxy 170S, New Brunswick, Nemecko). Potkanie primárne kultúry hepatocytov boli potom vystavené pôsobeniu 20 uM TAT-Gap24, 20 uM TAT-Gap19, 50 uM CBX alebo kontrole s vehikulom počas 30 minút. Tieto experimenty sa uskutočňovali 24 hodín po izolácii primárnych hepatocytov.

Histopatologické vyšetrenie

Vzorky pečeňového tkaniva boli fixované v 10% fosfátom pufrovanom formalíne po dobu 24 hodín a zaliate do parafínového vosku. Vzorky boli v 5. M-rezy narezané a zafarbené hematoxylínom-eozínom na vyhodnotenie steatózy, hepatocelulárneho balónovania, lobulárneho zápalu a NAS, ako bolo opísané vyššie 22. Stupeň steatózy sa hodnotil pomocou nasledujúcej 4-bodovej stupnice, steatózy stupňa 0, ktorá zahŕňala 66% hepatocytov. Zápal lalokov bol hodnotený tiež na 4-bodovej stupnici, konkrétne stupeň 0, žiadne ohniská; 1. stupeň, menej ako 2 kŕdle na pole × 20; 2., 2. až 4. kŕdeľ na každé pole × 20; Stupeň 3, viac ako 4 kŕdle na pole × 20. Tvorba balónov s hepatocytmi bola hodnotená na 3-bodovej stupnici: 0, žiadny; 1, niektoré balónové bunky; 2, akékoľvek/vyčnievajúce bunky balónu. Pre NAS boli znaky steatózy, lobulárneho zápalu a balónu s hepatocytmi kombinované s hodnotami od 0 do 8.

Analýza sérových aminotransamináz, sérových a pečeňových triglyceridov a cholesterolu

Pečeňové lipidy sa extrahovali zmesou chloroform/metanol. Konkrétne sa pečeňové tkanivo homogenizovalo v 1 ml roztoku chloroform/metanol v pomere 2: 1 a trepalo sa 1 hodinu pri 22 ° C v Thermomixéri (Eppendorf, Nemecko). Vzorky sa centrifugovali pri 5 000 x g počas 10 minút, potom sa odstránil supernatant. Ďalej sa použije 200 p.l. Pridalo sa 1 destilovanej vody a vzorky sa centrifugovali pri 8 000 x g počas 5 minút. Spodná fáza sa sušila cez noc pri 37 ° C. Pred analýzou boli lipidy rozpustené v 400 ul butanolu (Sigma, USA). ALT, AST, triglyceridy a cholesterol sa merali chemickým analyzátorom (Labmax 240, Labtest, Brazília). Výsledky boli vyjadrené v IU/l pre AST a ALT, mg/dl pre sérové ​​triglyceridy a cholesterol a µg/mg pre pečeňové triglyceridy a cholesterol.

Analýza zápalových pečeňových cytokínov

Pečeňové tkanivo sa homogenizovalo v lyzačnom pufri s inhibítormi proteázy (Roche, Nemecko). Homogenáty boli centrifugované pri 14 000 x g počas 15 minút pri 4 ° C a koncentrácie proteínov v supernatantoch boli stanovené Bradfordovou metódou 62 s použitím komerčnej súpravy (Bio-Rad, USA) s hovädzím sérovým albumínom ako štandardom. Súpravy ELISA sa použili na meranie hladín IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-y a TNF-a (BD Biosciences, USA) v pečeni 63.

Analýza pečeňových antioxidačných enzýmov

Analýza celého transkriptomu

Analýza imunoblotu

Imunoblotová analýza pečeňového tkaniva sa uskutočňovala tak, ako už bolo opísané 63. Nitrocelulózové/PVDF membrány sa inkubovali cez noc pri 4 ° C s primárnou protilátkou namierenou proti Cx26 (zriedenie 1/1000), Cx32 (zriedenie 1/1000), Cx43 (zriedenie 1/1000), CD36 (zriedenie 1/250), NADPH oxidáza. (Zriedenie 1/250) a LY86 (zriedenie 1/500) (Sigma, Belgicko) s následnou inkubáciou po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti s vhodnou sekundárnou protilátkou (zriedenie 1/1000 pre Cx26, Cx32 a Cx43; zriedenie 1/500 pre CD36, NADPH oxidáza a LY86) (Dako, Dánsko). Denzitometrická analýza sa uskutočnila pomocou softvéru Image Lab 5.0 (Bio-Rad, USA). Na účely semikvantifikácie sa signály normalizovali proti celkovému proteínu, merali sa pomocou gélov bez škvŕn a vyjadrili sa ako relatívne zmeny v porovnaní so zvieratami kŕmenými ND.

Štatistická analýza

Počet biologických (n) a technických (N) opakovaní pre každú analýzu sa menil a je uvedený v diskusii o výsledkoch. Všetky údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Výsledky boli štatisticky spracované jednosmernou analýzou rozptylu s post hoc Bonferroniho korekciou. Všetky dáta boli spracované pomocou softvéru GraphPad Prism6, pričom hodnoty pravdepodobnosti (p) menšie ako 0,05 boli považované za významné.

vďakyvzdania

Autori sa chcú poďakovať Dinji De Winovej, Tineke Vanhalewynovej, Paulovi Claesovi a Stevenovi Bransonovi za obetavú technickú prácu. Táto práca bola finančne podporená z grantov Univerzity v São Paulo - Brazília, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (grant FAPESP SPEC 2013/50420-6 a 2016/16182-9), Európskej rady pre výskum ( ERC Starting Grant 335476), Fond pre vedecký výskum - Flámsko (FWO granty G009514N a G010214N) a Fakultná nemocnica Vrije Universiteit Brussel - Belgicko („Willy Gepts Fonds“ UZ-VUB).

Dodatočný elektronický materiál

Ďalšie informácie

Poznámky

Odoslaním komentára vyjadrujete súhlas s našimi podmienkami používania a pokynmi pre komunitu. Ak zistíte, že niečo zneužíva alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte to ako nevhodné.