Kapitola VII Patologická chrupavka a degradácia chrupavky - PDF na stiahnutie zadarmo
Kapitola VII: Patologická chrupavka a degradácia chrupavky - Čo patrí k „reumatizmu“ - Ako diagnostikujete reumatizmus? - Ako si predstavuješ ten mechanizmus? - O ktoré bunky ide? Biofyzikálna chémia chrupavky 197
Čo má spoločné s „artritídou“? "Artritída": "Art" = kĺb + "itis" = zápal Artritída = zápal kĺbov Systémový lupus erythematosus spondyloartrózy (ochorenia stavcov/chrbtice) Psoriáza spondylitída (ankylozujúca spondylitída) Reiterov syndróm Artritída Dna Reumatoidná artritída Osteoartritída Častejšia ako artritída všetky ostatné choroby spolu! Biofyzikálna chémia chrupavky 198
Zápalové ochorenia kĺbov - artritída - kĺbová chrupavka (bez ciev) Priebeh tunica synovialis (koža chrupavky) Artritída = synoviatitída Porušenie sekrécie a zloženie synovie Dôsledky/charakteristiky: Kĺbové výpotky Tvorba hnisu Zničenie/funkčné obmedzenie chrupavky Akútna reumatoidná artritída Aschoffov granulóm v synoviálnej vrstve kolena (tri týždne) Trvanie choroby) Aschoffov granulóm: Zmes veľkých buniek spojivového tkaniva, leukocytov a plazmatických buniek Biofyzikálna chémia chrupavky 199
Reumatoidná artritída (chronická polyartritída) Chronické ochorenie s neznámou zákernosťou s akútnymi relapsmi Asi 70% pacientov sú ženy,
6% detí Etiológia Prvý výskyt ochorenia vo veku 40 až 60 rokov Autoimunitné ochorenie (veľmi pravdepodobné!) A) Schéma deštrukcie kĺbovej chrupavky pri reumatoidnej artritíde útokom na zápal kostí a kĺbov. b) Kostná ankylóza lakťového kĺbu Imigrácia granulocytov do kĺbového priestoru Veľmi často sa vyskytuje aj pri reumatizme mäkkých tkanív Biofyzikálna chémia chrupavky 200
Reumatoidná (-é) artritída (RA) Kto ňou trpí? Asi 40 miliónov Američanov má prvé príznaky RA; to zodpovedá asi 15% z celkovej populácie a rastie! Akútne postihnutých je 2,6 milióna Asi 75% postihnutých sú ženy Mimoriadne vysoké náklady na liečbu Čo spôsobuje RA? Presná príčina stále nejasná! Pravdepodobne: autoimunitné ochorenie! Najčastejšie postihnuté kĺby (napr. Lakte, kolená, plecia). Choroba môže postihnúť aj mäkké tkanivá a orgány (väčšinou srdce a pľúca). Príznaky RA a diagnóza? Príznaky sa líšia od pacienta k pacientovi! „Symetrický“ výskyt bolesti v oboch rukách alebo kolenách; postihnuté kĺby sú horúce! „Stuhnutosť“ v postihnutých kĺboch (najmä po vstávaní) Všeobecné: slabosť, únava, horúčka a strata hmotnosti Ochorenie môže rýchlo zmiznúť (aj bez liečby) a vrátiť sa až po rokoch Diagnostické kritériá: krv (reumatoidné faktory, C-reaktívny proteín), Punkcia (počet leukocytov); RTG alebo MRI biofyzikálna chémia chrupavky 203
Kritériá „ARA“ ARA = asociácia amerického reumatizmu Na diagnostiku sa používajú nasledujúce kritériá. „Reumatizmus“ je diagnostikovaný, ak je daných najmenej 7 z nasledujúcich kritérií (príznaky najmenej po 6 týždňoch): Ranná stuhnutosť najmenej 1 hodinu Ovplyvnené sú tri alebo viac kĺbov. Príznaky najmenej v jednom z veľkých kĺbov (koleno, lakeť). „Symetrická“ artritída, tj sťažnosti na rovnaké oblasti rôznych kĺbov „reumatoidné uzliny“ sú rozpoznateľné Dôkazy o reumatoidných faktoroch v sére Rádiologicky rozpoznateľné zmeny vo veľkom kĺbe Aj v Nemecku existujú v súčasnosti veľké centrá reumatizmu pre výskum a najmä pre štatistické zaznamenávanie chorôb Biofyzikálna chémia chrupavky 204
Toto sú rádiologické kritériá. Štádium I (podľa Steinbrockera): röntgenová rádiológia: nedostatok deštruktívnych zmien kĺbu na röntgene, ale príznaky miernej osteoporózy Klinické: opuch kĺbu a zhrubnutie puzdra kĺbu, ale bez deformácie kĺbu Funkcia: plne funkčné Rádiologické štádium II: mierne pokročilé štádium Povinné: röntgenom detekovateľná osteoporóza s alebo bez miernej deštrukcie chrupavky a kĺbov. Klinické: Žiadne deformity kĺbov, ale počiatočné obmedzenie pohyblivosti kĺbov. Zmeny mäkkých tkanív, ako napr Reumatoidné uzliny Funkcia: S výnimkou mierneho postihnutia jedného alebo viacerých kĺbov, stále dobrá pohyblivosť Rádiologické štádium III: pokročilé štádium Výrazná deštrukcia chrupavky a kostí Klinické: deformácie kĺbov, výrazná svalová atrofia. Spravidla sú prítomné extraartikulárne lézie mäkkých tkanív a reumatické uzliny Funkcia: Realizovateľnosť je výrazne obmedzená. Svojpomoc často nedostatočná Rádiologická fáza IV: konečné štádium vláknitej alebo kostnej ankylózy kĺbov. Funkcia: Väčšinou úplne zdravotne postihnutý, posteľ alebo výťah postihnutý. Svojpomoc bez tréningu prakticky nemožný Biofyzikálna chémia chrupavky 205
RA a OA sú zreteľne odlišné choroby. Sval „Abrázia chrupavky“ Kosť Bursa Synoviálna membrána Synoviálna tekutina Šľacha Chrupavka Kĺbová kapsula Rozstup kostí Redukcia Opuchnutá, zapálená synoviálna membrána Normálny kĺb Osteoartritída Reumatoidná artritída (polyartritída)
Pri reumatických ochoreniach sú narušené vzťahy medzi metabolickými dráhami, ktoré sa hromadia a rozkladajú. Anabol: Štruktúra; Katabolické: Degradačné skratky: IGF, inzulínový rastový faktor TGF, transformujúci rastový faktor BMP, kostný morfogenetický proteín CDMP, morfogenetický proteín odvodený z chrupavky IL, interleukín TNF, faktor nekrózy nádorov LIF, faktor inhibítora leukémie Biofyzikálna chémia chrupavky 207
Reumatizmus je určite „autoimunitné ochorenie“ Skratky: AG, antigén AK, protilátka IG, imunoglobulín PG, prostaglandín Normálny kĺb Synovitída Zničený kĺb Biofyzikálna chémia chrupavky 208
Ktoré bunky sa nachádzajú v krvi (zdravých) ľudí? Tkanivo a tekutina 92% krv 8% celková krv (objem) krvinky 46% krvná plazma 54% zložky buniek (počet/ml) hmotnosť plazmy erytrocyty
500 10 7 trombocytov 25 až 30 10 7 leukocytov 0,5 až 1 10 7 leukocytov voda 92% enzýmy, lipidy, anorg. Soli, vitamíny, hormóny atď. Bielkoviny 7% Bielkoviny Monocyty 2 až 8% Lymfocyty 20 až 40% Bazofily G2, G4 IgG1, G3> G2, G4 IgA IgG-Opsonins LTB 4 C5a PAF Histamín fmlp Ox. Aktivita fagocytóza ADCC aktivácia špeciálnych receptorov Biofyzikálna chémia chrupavky 211
Dôležité zložky granúl neutrofilných granulocytových granúl: Mikroskopicky detekovateľné „granule“ v bunkách, napr. v „granulocytoch“. Skladovacie miesta rôznych proteínov! Primárne granule (granule pozitívne na azurofil, peroxidázu) kyslé hydrolázy lyzozým katepsín B, D neutrálne proteinázy chlóracetát esteráza katepsín G β-glukozaminidáza elastáza β-galaktozidáza proteináza 3 β-glukononidáza bakteriálna permeabilita-α-manozidáza-zvyšujúca proteináza-oxidáza-oxidáza-oxidáza !) Špecifické granule (sekundárne granule) kolagenáza (MMP-8) apolaktoferín lyzozým proteín viažuci kobalamín C5a štiepiaci proteín aktivátor plazminogénu cytochróm b receptory pre fmlp CR3 laminín terciárne granule (želatináza pozitívne granule) želatinázové (MMP-9) receptory pre fmlp CR 1 CR 3 CR 45 sekrečné vezikuly albumín cytochróm b receptory alkalickej fosfatázy pre fmlp CR 1 CR 2 biofyzikálna chémia chrupavky 212
Izolácia neutrofilných granulocytov z ľudskej krvi zdravých darcov 2 ml heparínu (100 IU/ml) na 20 ml krvi darcu 2 ml dextránu na 22 ml heparínovej krvi Sedimentácia erytrocytov 30-60 minút väzba dextránu na glykokalyx erytrocytov Ľahký supernatant (
2 ml) pipetou s roztokom Ficoll (
2 ml) podložte roztok Ficoll-Hypaque. 3 Hustota = centrifugácia s gradientom hustoty 1,078 g/cm pri 15 ° C, 1 000 ot./min, 25 min. Supernatant zlikvidujte, kým plaky nie sú „biele“ (2 až 4 x) plaky s 1 ml dvakrát destilovanej H20. Opláchnite a inkubujte 1 minútu. Naplňte skúmavky HBSS-1. Odstreďujte. Lýza buniek erytrocytov. Lýza sa zastaví pri 15 ° C, 1 000 ot./min., 10 minút. Opláchnite biele plaky 1 ml HBSS-1. Počítanie buniek neutrofilov. Uchovávajte pri 4 ° C. Biofyzikálna chémia chrupavky 213
Možné noxy pri izolácii neutrofilných granulocytov Dextrán (polysacharid) pripomína lipopolysacharidy Gramnegatívne baktérie Kontakt bunky s bunkou ++ Adhézia k povrchom +++. Heparín ako antikoagulant. Šmykové napätie pri pipetovaní + osmotické napätie pri lýze erytrocytov ++ Kontakt neutrofilov s bunkovými zvyškami, membránami, proteínmi, lipidmi Mechanické napätie pri centrifugácii s gradientom hustoty Vplyv teploty +++ ++ +++ Zvýšenie receptorov integrínu a FcIII Zvýšenie receptorov CR1 Neutrofily sú veľmi citlivé bunky! Nemôžu byť pestované v kultúre ako mnoho iných buniek! Pretože musia byť neustále izolované od krvi darcu, sú výkyvy veľmi veľké! Biofyzikálna chémia chrupavky 214
Dva pekné obrázky o neutrofiloch: povrch neutrofilov pohyb améboidov neutrofily (v pozadí erytrocyt) biofyzikálna chémia chrupavky 215
Rozpoznávanie a odbúravanie mikroorganizmov PMN in vivo neaktívne PMN valcované PMN okrajové adherentné PMN postkapilárne venózne diapedéza neaktívne endotel AKTIVÁCIA PMN dopĺňajú systémovo špecifickú imunitnú obranu endoteliálna permeabilita aktívna opsonizácia CHEMOTAXIS PRIMING pozitívna spätná väzba mediátory cytokíny zápal tkanív poškodenie tkaniva fagocytóza
Neutrofily Granuloyzten a ďalšie bunky Pluripotentné kmeňové bunky myeloidné kmeňové bunky Lymfoidné kmeňové bunky prekurzory erytroidov myeloblast Mono Blast megakaryocyty erytroblasty prekurzor T-buniek prekurzor B-bunky krvné doštičky erytrocyty eozinofily chrupavky 217
Procesy poškodenia chrupavky pri reumatických ochoreniach Aj keď za poškodenie chrupavky môže byť zodpovedné veľké množstvo rôznych buniek (napr. Chondrocyty, T bunky, fibroblasty), sme toho názoru, že neutrofily hrajú obrovskú úlohu! Neaktívna bunka Stimulovaná degranulácia neutrofilov Ca 2+ Ca 2+ jadro NADPH oxidáza ROS NADPH oxidáza ROS ROS granule NADPH oxidáza O 2 _ MPO OH ENZYMY MPO H 2 O 2 1 O 2 HOCl Myeloperoxidáza Matrix Metalloproteinázy Elastáza Lysozým Ostatné enzýmy Interakcia ROS Inflamovaný. Aktivácia chrupavky O 2 prostredníctvom membránovo viazaných receptorov Fagolyzozóm Oxidačná aktivita Superoxidové aniónové radikály Peroxid vodíka Hydroxylové radikály Peroxynitrit Singletový kyslík Kyselina chlórna Biofyzikálna chémia chrupavky 218
Dôležité vlastnosti matricových metaloproteináz (napr. Kolagenáza, želatináza) Matricové metaloproteinázy MMP (podobnosti) rovnaká rodina génov (12 zástupcov, 4 triedy) veľká podobnosť v aminokyselinovej sekvencii Zn 2+ (obsahujúca), Ca 2+ (závislé) endopeptidázy sa aspoň vytvárajú zložka ECM (extracelulárna matrica) sa vylučuje v latentnej forme (zymogén, proenzým) Aktivácia pre proteolytickú aktivitu: HOCl, ATG, APMA, serínové proteázy Diskutuje sa o mechanizme aktivácie „cysteínový prepínač“ Úlohy: migrácia, vývoj, remodelácia kostí, Regulácia patologických proteínov: poškodenie tkanív, rast nádorov, metastázy Biofyzikálna chémia chrupavky 219
SDS-PAGE a zymografia na stanovenie aktivít MMP. Biofyzikálna chémia chrupavky 220
Tvorba reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a kyseliny chlórnej (HOCl) 02 NADPH oxidáza O 2 _ SOD Fe/Cu H 2 O 2 MPO HOCl NADPH NADP 1 OH O 2 myeloperoxidáza (MPO) reakcie natívny MPO (Fe 3+) HOCl _ HO O 2 _ "Kataláza" Cl _ Komplex _ III (Fe 3+ O 2) "Oxyperoxidáza" (nestabilná) Redukcia pomocou O 2 _, kyselina askorbová, močovina málo H 2 O 2 veľa komplexu I (Fe 3+ H 2 O 2) " chloračný peroxid "(veľmi nestabilná) aeróbna oxidácia komplexu NADH II (Fe 2+ H 2 O 2)" neaktívna forma "_ (žiadna oxidácia Cl) MPO je pomerne ťažký" enzým "! Biofyzikálna chémia chrupavky 221
Jeden možný prístup v liečbe reumatizmu: Inhibícia TNF-α: TNF-α TNF-α TNF-α aktivácia neutrofilov v synoviálnej tekutine Enzýmy kyseliny chlórnej Štiepenie synoviálnej tekutiny Migrácia neutrofilných granulocytov z krvi do spoločného priestoru „sprostredkovaná neutrofilmi“ Rozklad chrupavky TNF-α TNF-α „Adhézia“ buniek na povrch chrupavky Enzýmy kyseliny chlórnej Zničenie kĺbovej chrupavky TNF-α Blokovanie TNF-α významne tlmí zápal Prvé lieky sú v klinickom testovaní (napr. Enbrel) Ale: Táto liečba je mimoriadne drahá (
20 000 DM na pacienta!) Biofyzikálna chémia chrupavky 222