Kvantifikácia chemotaktickej aktivity monocytov in vivo a charakteristika monocytov v krvi

Zhrnutie

Tu uvádzame protokol na kvantifikáciu chemotaktickej aktivity krvných monocytov na myších modeloch na vyhodnotenie účinkov výživových, farmakologických a genetických zásahov na krvné monocyty a makrofágy odvodené od denmoncytov v myších modeloch s monocytovo-chemoatraktantným proteínom-1 (MCP-1). - gélové zátky s ventiláciou bazálnej membrány.

Abstrakt

Úvod

Protokol

Všetky metódy opísané v tomto protokole boli schválené Výborom pre ústavnú starostlivosť a použitie zvierat Lekárskej fakulty Wake Forest.

1. Príprava roztoku odvodeného od bazálnej membrány s obsahom MCP-1 a s rastovým faktorom

POZNÁMKA: Toto je sterilný postup.

2. Injekcia roztoku získaného z membrány suterénu

3. Zber gélovej zátky odvodenej od bazálnej membrány

4. Digestujte gélovú zátku odvodenú od bazálnej membrány

5. Stanovenie bunkového zloženia v bunkovej suspenzii analýzou jednobunkového westernového prenosu (scWB)

6. Vytiahnite čip scWB

Reprezentatívne výsledky

Aby sme získali prístup k chemolockantnej odozve krvných monocytov, vstrekli sme do ľavého a pravého boku každej myši roztok odvodený od membrány s obsahom vehikula a MCP-1. Gélové zátky odvodené od bazálnej membrány sa odstránili, oddelili a bunky sa zhromaždili do každej zátky 1, 3 a 5 dní po injekcii (obrázok 1A)). Odčítaním počtu buniek v konektore naplnenom vo vozidle (prázdne pruhy) od počtu buniek v konektore naplnenom MCP-1 (uzavreté pruhy), sme získali počet buniek, ktoré boli špecificky vybrané v reakcii na MCP-1 (počet buniek, obrázok 1B)). Pozorovali sme zrýchlený nábor a akumuláciu buniek špecifických pre MCP-1 v priebehu 5 dní, s rýchlosťou zvyšujúcou sa z 31 000 buniek/deň (deň 1) na 78 000 buniek/deň (deň 3) a 136 000 buniek/deň v deň 5 (obrázok 1B).

Štatistické vyhodnotenie tu uvedených údajov sa uskutočnilo pomocou analytického softvéru (napr. SigmaPlot 14). Na porovnanie priemerov medzi experimentálnymi skupinami sa použila ANOVA nasledovaná Fischerovým LSD testom. Všetky údaje sú uvedené ako priemerná hodnota SD z najmenej 3 nezávislých experimentov. Výsledky boli na úrovni P, obrázok 1 : Kvantifikácia buniek, ktoré prijatí do subkutánnych dermálnych gélových zátok v suteréne bude. (A.) Absolútne počty buniek pre gélové zátky s bazálnou membránou naplnené vehikulom (prázdne tyčinky) a uzavreté tyčinky. (B.) Počet buniek prijatých MCP-1 do gélových zátok odvodených z pivničnej membrány sa vypočítal ako rozdiel v počtoch buniek medzi zátkami naplnenými MCP-1 a vložkami obsahujúcimi vehikulum. Výsledky sa zobrazia ako priemerná hodnota sD (n = 4). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

monocytov

Obrázok 2 : Analýza bunkových populácií prijatých do gélových zátok odvodených od bazálnej membrány jednobunkovou analýzou Western blotom boli. (A + B) Reprezentatívne príklady analýzy scWB naloženého vozidla (Ovládanie) a požičiavací konektor MCP-1 (MCP-1), ktoré boli izolované z myši tri dni po injekcii. Čipy označené protilátkami proti CD45, CD11b a F4/80, po ktorých nasledujú fluorescenčné sekundárne protilátky, ako je opísané v protokole. Intenzita fluorescencie označeného pásu pre každú jednotlivú bunku je zobrazená ako oblasť špičky. (C + D) Populácie buniek boli identifikované ako monocyty (CD11b + F4/80 -,), makrofágy (CD11b + F4/80 + plus CD11b - F4/80 +,) alebo ako nemonocytové leukocyty (CD45 +,). Zvyšné bunky boli pomenované „ďalšie“ (). Výsledky sú uvedené ako priemerná hodnota sD (n = 3). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

vivo

Obrázok 3 : Obsah monocytov a makrofágov v gélových zátkach od firmy Dererampen. Kvantitatívna analýza prijatých hladín monocytov a makrofágov v zátkách naplnených vehikulom a MCP-1 bola odstránená 1., 3. a 5. deň po injekcii. Hodnoty sú vyjadrené ako percento z celkovej populácie buniek (A + B) a v absolútnom počte článkov na konektor (C +D.) sa zobrazí. Výsledky sú uvedené ako priemerná hodnota sD (n = 3). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Diskusia

Existuje niekoľko obmedzení testu, ktoré je potrebné vziať do úvahy. Najskôr manipulácia s myšou, vrátane anestézie, injekcie roztokov odvodených od bazálnej membrány a chirurgické oplachovanie, vyžaduje prax na generovanie jednotlivých zátok a reprodukovateľných údajov. Po druhé, zatiaľ čo väčšina buniek, ktoré sa regrutujú do zátok obsahujúcich MCP-1, sú monocyty a makrofágy, významný počet nie je. To môže ovplyvniť interpretáciu iných analytických testov, ktoré nie sú založené na jednej bunke, uskutočňovaných na tejto bunkovej populácii. Pretože podmienky lýzy buniek pre scWB sú mierne, môžu sa migračné vzdialenosti proteínov líšiť od štandardného WB a nekorelovať s veľkosťou proteínu. Preto musí byť pre každý nový testovaný proteín a pre každú primárnu protilátku validovaná tak lýza buniek, ako aj doby chodu.