Laborjournal online Journalclub - voda v ceste
Karin Hollricher
Marburg: Molekuly vody sú rozhodujúce pre väzby medzi bielkovinami a ligandmi. Preto si ich chemici a farmaceuti pozorne prezerajú.
Neutrónová kryštalografia, kalorimetria, entalpia, entropia - to sú heslá, ku ktorým čitateľ článku Johannesa Schiebela a jeho kolegov z Philippsovej univerzity v Marburgu doslova skočí (Nat. Commun. 9: 3559). Slová, ktoré okamžite naznačujú: Tu sa to komplikuje. „Naše články sa čítajú takmer vždy veľmi ťažko,“ hovorí hlavný autor Gerhard Klebe, ktorý vedie výskum na Inštitúte pre farmaceutickú chémiu na univerzite v Marburgu. „Ale ak sa prehryzneš, skutočne z toho niečo máš.“ Dobre, pozvanie prijímame.
Klebe a jeho kolegovia v pracovnej skupine pre design liekov chcú optimalizovať aktívne farmaceutické zložky - a to nielen od včera. V Klebeovej profesionálnej kariére sa takmer všetko točilo okolo vzdelávania a zlepšovania účinkov liekov: študovaná chémia, jeden rok u zdroja neutrónov v Grenobli, postdoktorát v kryštalografii, viac ako desať rokov na BASF, od roku 1996 na univerzite v Marburgu a autor vysoko cenenej učebnice “ Dizajn aktívnej zložky “.
Bielkoviny musia tiež dostať von z tela molekuly vody, aby mohli viazať ligandy. Foto: iStock/cactuseskimo
Najnovšia publikácia jeho pracovnej skupiny sa tiež venuje zložitým vzťahom väzieb medzi proteínmi a ligandmi, presnejšie enzýmami a inhibítormi. Pokusy sú komplikované - vedci preto hľadali „jednoduchý“ proteín: trypsín. Tento enzým patrí do triedy serínových proteáz a môže byť inhibovaný N-amidinopiperidínom a benzamidínom.
Lekárnici a chemici okrem iného tvrdia, že voda určuje, či dve molekuly do seba dokonale zapadajú ako kľúč a zámok. Pretože bunkové proteíny pracujú vo vodnom roztoku a sú teda vysoko hydratované, je intuitívne zrejmé, že ligand, ktorý sa chce viazať, musí najskôr vytvoriť priestor a presunúť niekoľko molekúl vody. Táto téza však zatiaľ nebola dôkladne experimentálne dokázaná. Aspoň potvrdenie poskytoval enzým trombín, tiež serínová proteáza, ktorá je dôležitá pre zrážanie krvi. Po odstránení jednotlivých molekúl vody z väzbovej kapsy trombínu sa väzobné správanie inhibítorov dramaticky zlepšilo. Tento objav viedol k vývoju účinnejších antikoagulancií.
„Pokiaľ nevieme, kde sú molekuly vody a ako sa mení ich poloha, naše znalosti o interakcii medzi proteínmi a ich väzobnými partnermi zostávajú neúplné,“ vysvetľuje Klebe. „Museli sme metódy použiť na maximum, aby sme opísali správanie molekúl vody na trypsíne.“ A tým tím Marburg a jeho kolegovia v Janove, Jülichu, Hamburgu a Mníchove vyplnili 15 strán - plus dodatok!
Väzbová štúdia sa začala termodynamickými analýzami. Aj keď je už dlho známe, že termodynamické faktory majú rozhodujúci vplyv na väzobné správanie, bolo ich študované iba málo. Príliš komplikované. Vzorec používaný na opísanie termodynamického procesu, keď sa dve molekuly viažu, vyzerá skutočne jednoducho: ∆G ° = ∆H ° - T∆S °.
∆G, rozdiel v Gibbsovej energii medzi voľným a viazaným stavom, určuje reakciu. Tento rozdiel sa skladá z rozdielu medzi entalpiou H ° a entropiou S °. Entalpia je všetky energie obsiahnuté v systéme pri konštantnom tlaku. Entropia popisuje stav objednávky v systéme. Podľa druhého zákona termodynamiky reakcia prebieha dobrovoľne, keď ∆S má tendenciu k nule, t. J. G sa vplyvom reakcie zmenšuje.
Čo to znamená pre proteíny a ligandy? Silná väzba je vždy spojená s malou Gibbsovou energiou, rozdiel ∆G medzi voľnými a viazanými molekulami je potom zjavne negatívny. Tento rozdiel v energii možno preukázať ako prenos tepla pomocou izotermickej titračnej kalorimetrie (ITC). Väzobní partneri sa titrujú pri konštantnej teplote a množstvo tepla, ktoré vzniká, keď sa vytvorí komplex, sa meria pomocou kalorimetra. Dnes sú kalorimetre také citlivé, že sa dajú použiť na detekciu množstva tepla rádovo v mikrokalóriách. Meranie tepla je jednoduchý experiment a softvér prístroja spoľahlivo dodáva ∆H °, väzbovú konštantu a teda aj Gibbsovu energiu. Ale to nie je všetko. Tvrdým orieškom je hodnotenie: ktoré atómy alebo väzby prispievajú k zmene energie?
Ak ligand vytlačí silne fixovanú molekulu vody a dôjde k novým hydrofóbnym interakciám, je zisk entropie väčší, ako keby musela ustúpiť menej pevne viazaná molekula vody. „Bohužiaľ však entalpia a entropia často pôsobia proti sebe,“ vysvetľuje Klebe. Na optimalizáciu väzby preto nestačí modifikovať ligand tak, aby sa znižovala iba entropia. „Je potrebné vziať do úvahy zmenu rozdielov medzi entropiou a entalpiou.“
V Marburgu Tobias Wulsdorf, chemik so znalosťou počítačovej vedy, skutočne vypustil paru v systéme termodynamických vzorcov väzby inhibítorov trypsínu. Ukázal, že silnejšia väzba benzamidínu v porovnaní s inhibítorom piperidínu je entalpicky výhodná.
Na ilustráciu úlohy molekúl vody autori určili kryštálové štruktúry. Zvyčajne sa na to používajú röntgenové lúče. Podľa Klebeho to však nie je dosť citlivé na presnú lokalizáciu molekúl vody. Preto použili žiarenie zo zdroja neutrónov na Technickej univerzite v Mníchove. Pre neutrónovú kryštalografiu sú potrebné veľmi veľké proteínové kryštály. Ich výroba je umenie. „Zlatými prstami“ nadchol Klebe, prvý autor a potom doktorand Johannes Schiebel, ktorý vytvoril kryštály trypsínu - s ligandmi aj bez nich. Klebe: „Na difrakcii neutrónov je vynikajúce to, že žiarenie neničí proteínové kryštály a merania je možné prerušiť a potom pokračovať. Boli sme schopní merať na kryštáli celé týždne - s prerušeniami - a dosiahnuť tak rozlíšenie menej ako 1,5 angstromu. Toto sú najlepšie rozlíšené neutrónové štruktúry, aké sa doteraz na proteínoch tejto veľkosti uskutočňovali. ““
Zistite viac o našich nových produktoch a objednajte si nový katalóg 2021 ešte dnes na adrese. viac
Ale to nie je všetko: chemici určili aj röntgenové kryštalické štruktúry. Veľkou výzvou bolo vykonať röntgenové merania, ako je neutrónová difrakcia pri izbovej teplote, aby bolo možné údaje následne porovnať a skombinovať. Klebe: "Dokázali sme vypočítať kombinovanú štruktúru X-N (poznámka redaktora: X znamená X-Ray, N pre neutróny) z röntgenových a neutrónových dát a použiť ju s termodynamickými dátami pre počítačové simulácie."
Tím našiel deväť molekúl vody okolo aspartátu 189 vo väzobnom vrecku trypsínu. Tri sú priamo vo väzobnom vrecku trypsínu, ďalšie štyri sú viac-menej za aspartátom a slúžia ako „rezervoár“, ak dôjde k strate jednej z vnútorných molekúl. Čo sa môže ľahko stať, pretože vnútorné molekuly vody nie sú tak pevne spojené iba s dvoma vodíkovými väzbami ako vonkajšie s tromi. Zvyšok je o niečo ďalej.
Vedci z Marburgu preukázali, že inhibítor vytláča molekulu vody, keď sa viaže. Vo výsledku sa zmení orientácia inej molekuly vody: približuje sa k tyrozínu 228 a vytvára novú vodíkovú väzbu. Vo výsledku je pevnejšie zafixovaný a už sa nemôže voľne otáčať, čo vedie k „entropickému trestu“, ako píšu autori. Tieto a mnohé ďalšie veľmi podrobné pozorovania ukázali, ktoré vodíkové väzby a hydrofóbne interakcie sú porušené tvorbou komplexov a ktoré sú novovzniknuté. Klebe: "Veríme, že vodné štruktúry v proteíne a stav nabitia na aspartáte sú zodpovedné za rôzne väzbové afinity týchto dvoch inhibítorov k trypsínu."
Skúsenosti, ktoré Klebe v priebehu rokov získal na univerzitách a v priemysle, by sa v budúcnosti nemali využívať výlučne v papierovej podobe. V marci založili bývalí zamestnanci spoločnosti Klebe s jeho podporou spoločnosť CrystalsFirst. Cieľom je pomocou novej technológie známej ako „SmartSoak“ stabilizovať proteínové kryštály, určiť ich 3D štruktúru a prejsť tak zbierkou kandidátov na lieky pomocou softvéru. „Takto môžu byť geometrické údaje, ktoré sú nevyhnutné pre moderný farmaceutický výskum, dodané rýchlo a predovšetkým spoľahlivo vo veľmi ranom štádiu hľadania liekov, a je výrazne znížené veľké úsilie spojené s hľadaním liekov,“ uvádza sa v tlačovej správe nadácie spoločnosti. Uvidíme, či sa to splní.
(Neúplná) pracovná skupina chemika Gerhard Klebe (chrbát, otvorená bunda) sa rada vydá na objavné turné: Obzvlášť obľubujú kryštály - či už v jaskyniach alebo s bielkovinami. Foto: AG Klebe