Ľudské glykoproteíny zo živočíšnych bunkových kultúr - spektrum vedy
Ľudské glykoproteíny z bunkových kultúr zvierat
Lekárske pozadie
Štruktúra ligandu P-selektínu je známa. Na „kostre“ proteínu, aminokyselinovom reťazci, je päť molekúl cukru (konkrétne fukóza, galaktóza, N-acetyl-galaktozamín, N-glukozamín a kyselina neuramínová) usporiadaných v určitej konfigurácii na aminokyseline. Aby sme zvýšili šance na úspech nášho projektu, sledovali sme dve rôzne stratégie: V prípade cesty in vitro sa mimo živého organizmu vytvára štruktúra cukru na peptide špeciálnymi enzýmami, glykozyltransferázami. Väčšina potrebných enzýmov nie je komerčne dostupná. Musia sa vyrábať biotechnologicky. Na tento účel sa genetická informácia o ľudskej glykozyltransferáze zavádza do bunky CHO. Gén pre glykozyltransferázu je spojený so signálnou sekvenciou, ktorá spôsobuje, že bunka sekretuje transferázu. Tieto bunky sa potom rozmnožia a použijú v bunkových kultúrach na výrobu glykozyltransferáz. V ďalšom kroku sa takto získané enzýmy použijú na vytvorenie cukrovej štruktúry P-selektínového ligandu. Nakoniec je možné skontrolovať správne usporiadanie molekúl cukru pomocou hmotnostnej spektrometrie.
Pri ceste in vivo sa do živej bunky vnáša genetická informácia pre rôzne ľudské glykozyltransferázy a genetická informácia pre proteín, ktorý sa má glykozylovať, do jednej bunky CHO. Gény glykozyltransferáz nie sú tentokrát vybavené signálnou sekvenciou. To lokalizuje transferázy v Golgiho aparáte, bunkovej organele (ktorá je zodpovedná za kondenzáciu a pokrytie sekrétov). Génu pre proteín predchádza signálna sekvencia. Je teda „predprogramovaný“ na výboj a na svojej ceste z bunky prechádza Golgiho aparátom. Glykozyltransferázy tu už čakajú na prenos molekúl cukru do proteínu. Výhodou tejto stratégie je, že bunka vylučuje biologicky aktívny ligand P-selektínu. Ťažko však spočíva v usporiadaní týchto rôznych glykozyltransferáz v správnom pomere k sebe navzájom v Golgiho aparáte.
Výsledky výskumu
Použitím metódy in vitro sa nám podarilo biotechnologicky vyrobiť päť rôznych glykozyltransferáz. S týmito enzýmami sme syntetizovali štruktúru cukru, ktorá je veľmi podobná cieľovej štruktúre. Musí byť pridaná iba jedna molekula cukru - a požadovaná glykozyltransferáza je komerčne dostupná. Bunková línia, ktorá exprimuje ľudský P-selektínový ligand v biologicky aktívnej forme, by sa mala produkovať in vivo cestou. Po dvoch rokoch výskumu genetického inžinierstva máme teraz niekoľko bunkových línií, ktoré spĺňajú túto požiadavku. Výroba nášho cieľového proteínu v bioreaktoroch už začala.
Vďaka vynikajúcej spolupráci medzi výskumnými skupinami z piatich európskych krajín bolo možné spojiť biotechnologické poznatky distribuované po celej Európe a dosiahnuť cieľ projektu. Okrem Ústavu pre biotechnológie na Forschungszentrum Jülich boli zapojené aj Ústav pre fyziológiu na Univerzite v Zürichu, Zubná škola na Univerzite v Kodani, Ústav pre enzýmovú technológiu na Univerzite v Düsseldorfe, Katedra bioorganickej chémie na Univerzite v Utrechte a Ústav pre glykobiológiu na Oxfordskej univerzite. . Spoločne sme podnikli prvé úspešné kroky na sprístupnenie proteínu s vysokým terapeutickým záujmom. Nasledujúce obrázky ukazujú, aký vysoký je tento záujem: Z 350 geneticky upravených liekov, ktoré sa v súčasnosti klinicky testujú v USA, je iba desať určených na liečbu septických symptómov.