Merania odpovedí fyziologického stresu v C

Zhrnutie

Tu charakterizujeme bunkové proteotoxické stresové reakcie u nematódy C. elegans meraním aktivácie reportérov fluorescenčnej transkripcie a pozorovaním citlivosti na fyziologický stres.

Abstrakt

Úvod

Veľa poznatkov o regulácii a aktivite bunkových stresových reakcií sa pripisuje nematode Caenorhabditis elegans, mnohobunkovému modelovému organizmu použitému pri genetickom výskume. Nematódy umožňujú študovať nielen aktiváciu stresových reakcií na bunkovej úrovni, ale aj na úrovni organizmu; Nematódy sa používajú na štúdium účinkov genetických porúch alebo vystavenia účinkom liekov a znečisťujúcich látok na ich rast a prežitie. Ich rýchla generačná doba, izogenéza, priehľadnosť, schopnosť genetickej trakcie a ľahké použitie počas experimentov ich robí ideálnymi pre takéto štúdie. Okrem toho pomerne rýchla fyziologická reakcia na stres (medzi hodinami a niekoľkými dňami) a evolučná ochrana bunkových dráh robia z nematód vynikajúci nástroj pri štúdiu odolnosti proti stresu.

Okrem reportérovej analýzy je možné merať citlivosť alebo odolnosť zvierat voči stresu pomocou fyziologických záťažových testov. To sa dosiahne vystavením zvierat stresujúcemu prostrediu, ktoré aktivuje určité dráhy bunkového stresu. Tu sú ponúkané rôzne metódy merania citlivosti celých zvierat na určité typy stresorov.

ER stres sa aplikuje na C. elegans pomocou chemického činidla tunikamycín, ktorý blokuje N-viazanú glykozyláciu a spôsobuje akumuláciu nesprávne zložených proteínov v ER 10. U C. elegans vedie rast k významným poruchám vo funkcii ER a k významne zníženej životnosti po expozícii tunikamycínu 11. Meraním prežitia zvierat na doštičkách obsahujúcich tunikamycín možno kvantifikovať ER stresovú citlivosť zvierat. Napríklad zvieratá s ektopickou indukciou UPR-ER a teda so zvýšenou odolnosťou voči stresu z nesprávneho poskladania proteínu v ER majú zvýšené prežitie po expozícii tunikamycínu v porovnaní s divými zvieratami 12. ON

Oxidačný a mitochondriálny stres sa na C. elegans pôsobí vystavením zvierat chemickému činidlu parakvat. Parakvát je bežne používaný herbicíd, ktorý špecificky spôsobuje tvorbu superoxidov v mitochondriách 13. Kvôli špecifickej lokalizácii mitochondrií odvodených reaktívnych foriem kyslíka (ROS) sa paraquatové testy často používajú ako „mitochondriálny“ záťažový test. Superoxid sa však rýchlo mení na peroxid vodíka mitochondriálnymi superoxiddismutázami (SOD) 14. Peroxid vodíka potom môže difundovať z mitochondrií a spôsobiť oxidačný stres v iných častiach bunky. Preto popisujeme testy prežitia parakvátu ako mieru citlivosti na mitochondriálny aj oxidačný stres (ďalšie testy oxidačného stresu pozri 15).

Testy tepelnej kompatibility sa uskutočňujú na C. elegans umiestnením zvierat do zvýšených teplôt. Okolité teploty pre nematódy sú 15 - 20 ° C a tepelné napätie sa vyvoláva pri teplotách nad 25 ° C 16, 17. Testy tepelnej kompatibility sa zvyčajne uskutočňujú pri teplotách 30 - 37 ° C, pretože zvieratá majú pri tejto teplote veľké bunkové defekty a testy prežitia sú ukončené do 24 hodín 16, 18. Pri uskutočňovaní testov termotolerancie sú tu uvažované dva alternatívne spôsoby: rast pri 34 ° C a rast pri 37 ° C. Tu uvedené protokoly možno spoločne použiť na uskutočnenie rozsiahlych skríningov v kombinácii so štandardným odbúravaním génov s interferenciou RNA alebo knižnicami chemických liekov.

Protokol je možné rozdeliť na 4 všeobecné postupy - rast C. elegans a príprava na zobrazovanie (oddiel 1 a 2), zobrazovanie reportérov transkripcie pomocou fluorescenčnej mikroskopie (sekcie 3-5), kvantitatívne merania reportérov pomocou veľkého toku častíc - Cytometer (časť 6) a fyziologické ihly na meranie citlivosti na stres u C. elegans (časť 7).

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

1. Štandardné podmienky rastu pri teplotách & OP50 a HT115

2. Fáza/synchronizácia červov bielením

5. Zobrazovanie so stereoskopickým mikroskopom alebo so zloženým mikroskopom s malým zväčšením

6. Kvantitatívne merania od reportérov s veľkým prietokovým cytometrom častíc

POZNÁMKA: Rast a príprava červov na analýzu cytometra s plnou dĺžkou s veľkými časticami sa môžu riadiť rovnakými paradigmami ako v častiach 1 až 5 na prípravu červov na fluorescenčné zobrazovanie, s tým rozdielom, že je potrebný väčší počet zvierat . Použite> 500 zvierat za podmienok, pretože niektoré zvieratá sa počas manipulácie stratia, nie všetky zvieratá spĺňajú filtračné kritériá počas kvantifikácie a niektoré zvieratá nebudú prietokovým cytometrom správne prečítané. Umyte zvieratá na triedenie platní v 5-10 ml roztoku M9 v 15 ml kónických skúmavkách na následné triedenie na prietokovom cytometri.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Používanie reportérov prepisu na meranie aktivácie stresových reakcií
Tu sa používajú fluorescenčné transkripčné reportéry, ktoré slúžia ako robustný nástroj na meranie aktivácie väčšiny stresových reakcií u C. elegans. Expresia GFP je riadená podporou kanonických cieľov hlavnými transkripčnými regulátormi zapojenými do reakcie na stresy špecifické pre daný subjekt. Komplexný zoznam bežne používaných reportérov prepisu nájdete na Tabuľka 3.

Fyziologické testy na meranie citlivosti na stres u C. elegans
C. elegans sú skvelým modelovým organizmom na meranie citlivosti na stres kvôli nízkym nákladom na údržbu a experimentom a ľahkej editácii genómu alebo genetickému odbúravaniu pomocou RNAi, čo ponúka schopnosť vykonávať rozsiahle experimenty v celom organizme. Aby sme stanovili toleranciu stresu voči stresu ER, vystavili sme C. elegans chemickému tunikamycínu, ktorý spôsobuje akumuláciu poškodených proteínov v ER blokovaním N-viazanej glykozylácie 10. Zvieratá sú po vývoji vystavené pôsobeniu tunikamycínu, pretože liek spôsobuje vývojové chyby. Keď sú dospelí červy vystavení pôsobeniu tunikamycínu, vykazujú výrazné zníženie životnosti. Okrem toho knockdown génu xbp-1, ktorý kóduje jeden z primárnych transkripčných faktorov zapojených do indukcie UPR ER, vedie k významnému zvýšeniu citlivosti na tunikamycín (obrázok 5)A.) 12. ER Toto teda slúži ako robustný test na meranie citlivosti na stres ER u dospelých červov.

Na meranie oxidačného stresu a mitochondriálneho stresu vystavujeme zvieratá chemickej zlúčenine paraquat. Parakvát spôsobuje mitochondriálny stres syntézou ROS v mitochondriálnej matrici, ktorú je potom možné previesť na peroxid vodíka a difundovať z mitochondrií a spôsobiť tak oxidáciu buniek na celé bunky 13. Podobne ako pri stresových testoch ER, aj v dospelosti vystavujeme zvieratá parakvátu. Robíme však testy na tekutý parakvát, aby sme znížili náklady a manuálnu prácu, a testy na agarových doštičkách by boli pre väčšinu laboratórií náročné. Tu ukážeme, že zvieratá vystavené parakvátu v tekutej tekutine majú priemerné prežitie okolo 5 hodín (obrázok 5B.). Okrem toho odbúranie inzulínového receptora daf-2 vedie k zvýšenej odolnosti voči parakvátu, pretože aktivácia DAF-16/FOXO vedie k zvýšenej expresii druhov zapojených do klírensu ROS, napr. B. Sod-3 42,43. Testy na prežitie parakvátu sú krátke, trvajú až 14 hodín a slúžia teda ako účinná metóda na spochybnenie odpovedí mitochondriálneho a oxidačného stresu.

Tabuľka 3: Transkripčný reportér na hodnotenie aktivácie bunkových stresových reakcií. Všetky uvedené kmene sú k dispozícii prostredníctvom CGC alebo prostredníctvom špecifických dotazov laboratóriám na použitie pri kvalitatívnych a kvantitatívnych zobrazovacích postupoch opísaných v tomto rukopise. Všetky tieto kmene pochádzajú z pozadia Bristol N2. Poskytnuté sú aj odporúčané metódy pôsobenia stresu na aktiváciu reportérov. Všetci reportéri, s výnimkou sod-3p: GFP 45 a T24B8.5p: GFP 46, sú opísaní v texte.

Transgénne	Odporúčané aplikácie napätia	Čas expozície stereofónnym mikroskopom Leica M2250FA	Čas expozície pomocou mikroskopu Revolve ECHO	Hodnoty PMT pomocou organického triediča Union Biometrica COPAS
hsp-4p: GFP	25 g/ml tunikamycínu (približne 4 hodiny s nočným zotavením)	200 ms	275 ms	450
hsp-6p: GFP	3 M antimycín A (asi 16 hodín);	100 ms	50 ms	350
hsp-6p: GFP	RNAi proti ETC alebo mitochondriálnym ribozómom (z poklopu)	100 ms	50 ms	350
hsp-60p: GFP	3 M antimycín A (asi 16 hodín);	200 ms	100 ms	450
hsp-60p: GFP	RNAi proti ETC alebo mitochondriálnym ribozómom (z poklopu)	200 ms	100 ms	450
hsp-16.2p: GFP	34 ° C, 2 hodiny	400 ms	200 ms	500
hsp-70p: GFP	34 ° C, 2 hodiny	400 ms	300 ms	500
gst-4p: GFP	50 mM parakvat (približne 2 hodiny);	100 ms	50 ms	350
gst-4p: GFP	2 mM terc-butylhydroperoxid (približne 4 hodiny s nočnou relaxáciou)	100 ms	50 ms	350
sod-3p: GFP	RNAi proti Daf-2 (inzulínový receptor)	300 ms	300 ms	475
T24B8.5p: GFP	Expozícia patogénom (napr. P. aeruginosa)	100 ms	50 ms	350

Tabuľka 4: Odporúčané nastavenia pre fluorescenčnú mikroskopiu a kvantifikáciu pomocou biosorteru s veľkými časticami. Táto tabuľka slúži ako pomôcka pre odporúčané doby expozície pre fluorescenčnú mikroskopiu alebo hodnoty PMT pre biosorter s veľkými časticami. Slúžia ako dobré počiatočné body, ale čas expozície a hodnota PMT by sa mali pre každý experiment upraviť, aby sa zabezpečilo, že nenastane saturácia a že hodnoty fluorescencie budú nad detekčným limitom signálu pozadia. Ak je vzorka s najjasnejším signálom známa pre experiment (napr. Pozitívne kontroly na indukciu napätia), môžu sa tieto vzorky použiť na určenie najvyššej doby expozície alebo PMT, ktorú je možné použiť bez signálu nasýtenia. Ak nie sú známe najjasnejšie vzorky, je možné použiť ovládač a použiť expozičný čas alebo PMT uprostred dynamického rozsahu vášho systému.

Tabuľka 6: Odporúčané génové ciele a páry primérov na meranie transkripčnej upregulácie génov stresovej reakcie.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Ďalším obmedzením opísaných metód je to, že zobrazovanie a kvantifikácia biosorterom má obmedzenú priepustnosť. Zatiaľ čo kvantifikáciu biosorterov v 96-jamkových doštičkách je možné vykonať pre vyššiu priepustnosť, stále je to obmedzené potrebou prenášať červy do roztoku, zatiaľ čo zobrazovanie je obmedzené schopnosťou skúšajúceho pripravovať červy a vykonávať mikroskopiu, je obmedzený. Preto veľké obrazovky budú s najväčšou pravdepodobnosťou obsahovať iba vizuálne skríning fluorescenčného reportérového signálu, pričom budú mapované a kvantifikované iba zásahy.

Všetky tu opísané metódy môžu byť použité nezávisle alebo v kombinácii na komplexnú analýzu záujmových génov alebo liečiv a ich účinkov na stresovú reakciu. Veľkoformátové obrazovky je možné prevádzkovať s vysoko výkonnými transkripčnými reportérovými testami a sekundárne obrazovky je možné prevádzkovať s kvantitatívnou analýzou týchto reportérov. Len čo sa znova identifikujú zoznamy zvládnuteľných kandidátnych génov/liekov, je možné vykonať fyziologické testy na identifikáciu kandidátov, ktoré majú priamy vplyv na celkovú fyziológiu zvierat. Na overenie alebo ďalšie preskúmanie je možné použiť aj ďalšie vyššie navrhnuté metódy.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.