Nový očkovací potenciál rv3131, predpokladanej nitroreduktázy kódovanej dosr-regulonom, proti
predmetov
abstraktné
úvod
V tejto štúdii sme skúmali imunogenicitu a ochranné účinky Rv3131 formulovaného v GLA-SE (stabilná emulzia adjuvans glukopyranozyl lipidu), dobre definovaného adjuvans TLR4, ako vakcínovej platformy pre podjednotky proti expozícii hypervirulentnej Mtb K.
Výsledky
Prepis rv3131 je upregulovaný vo fáze exponenciálneho rastu, v hypoxickom stave a v makrofágoch bez ohľadu na fázu rastu vo virulentnom izoláte Mtb
38 kDa Rv3131 sa potvrdilo elektroforézou na géle dodecylsulfát-polyakrylamid sodný (SDS-PAGE) a Western blotom (1c).
( a ) Úroveň expresie rv3131 sa hodnotila pomocou qRT-PCR. Rozdielne zmeny skladania medzi Mtb H37Rv (svetlošedá tyčinka) a Mtb K (tmavo šedá tyčinka) za rôznych rastových podmienok, podmienky exponenciálnej fázy a hypoxickej kultúry boli stanovené pomocou metódy AACt a ako endogénna kontrola bola použitá expresia 16S rRNA. Ako pozitívna kontrola sa použil Rv3133c (dosR). ( ) QRT-PCR sa tiež použila na expresiu rv3131 Mtb v BMDM. Rozdielne zmeny skladania medzi Mtb H37Rv (svetlošedý stĺpec) a Mtb K (tmavošedý stĺpec) sa stanovili pomocou metódy ACAC a ako endogénna kontrola sa použila expresia 16S rRNA. Ako pozitívna kontrola sa použil Rv3133c (dosR). ( c ) Coomassie blue zafarbený 10% SDS-PAGE rekombinantným proteínom Rv3131 (ľavý panel), purifikovaný za podmienok bez endotoxínov a potvrdený Western blotom s antihistidínovou protilátkou (pravý panel). M: štandardný marker molekulovej hmotnosti.
Imunogenicita a imunologická pamäť indukovaná imunizáciou Rv3131
Každá skupina myší bola imunizovaná a eutanázovaná, ako je opísané v časti Metódy. Štyri týždne po poslednej imunizácii boli myši v každej skupine usmrtené a ich bunky pľúc a sleziny boli ošetrené Rv3131 (5 μg/ml) pri 37 ° C počas 12 hodín v prítomnosti Golgi Stop. ( a ) Stratégia hradlovania použitá na identifikáciu populácií multifunkčných T buniek špecifických pre Ag. ( ) Pri stimulácii vakcínou Rv3131 Ag sa percentuálny podiel Ag-špecifických, multifunkčných CD4 + CD62L a CD8 + CD62L T buniek, ktoré produkujú TNF-, IFN- & ggr; a/alebo IL-2 produkujúce sa v bunkách pľúc a sleziny z každej imunizovanej skupiny boli hodnotené pomocou prietokovej cytometrie. Stredné frekvencie buniek produkujúcich efektorové cytokíny sú uvedené ako koláčové grafy. Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SD pre 5 myší z každej skupiny. Významnosť rozdielov sa stanovila nepárovým t-testom. Hodnota p
Okrem toho rozsiahla genetická variácia môže viesť k zmenám v účinnosti vakcíny a k dráham génovej expresie, ktoré sú dôležité pre vývoj vakcíny proti TBC. Napríklad Cohen a kol. predpovedá, že neúplné pochopenie rozmanitosti mykobakteriálnych kmeňov by mohlo mať významný negatívny vplyv na účinnosť vakcíny, pretože vakcína nahrádza necielené varianty Mtb kmeňom 38. Okrem toho Homolka a kol. navrhuje, aby genetická diverzita v kmeňoch Mtb posilňovala potrebu zaoberať sa výzvou používania rôznych kmeňov Mtb ako spoločného kroku pri testovaní vakcín a testovaní liekov 39 .
Preto sme predpokladali, že klinicky prevládajúce nadmerne exprimované Ags špecifické pre genotyp a kmeň Mtb môžu byť dobrými cieľovými Ag vakcínami. Nakoniec pomocou mikročipovej analýzy transkriptov génov sme zistili, že Rv3131 spĺňa vyššie uvedený štandard medzi génmi kódovanými regulonmi DosR. Pokiaľ je nám známe, je to prvýkrát, čo je Rv3131 súvisiaci s regulonom DosR účinný proti výzve vysoko virulentného klinického kmeňa Mtb z Pekingu.
V tejto štúdii sme skúmali, či Rv3131 produkoval počas infekcie Mtb K Ag špecifický IFN-y. -Reakcia (2a) a aký typ odpovede T-buniek je vyvolaný očkovaním Rv3131 a GLA-SE (2, 3 a 4) 5) pred a po expozícii. Naša štúdia ukázala, že Rv3131 indukoval Ag-špecifickú IFN-y reakciu počas Mtb K infekcie a že očkovanie Rv3131 a GLA-SE indukovalo silnú Ag-špecifickú pamäťovú T-bunkovú odpoveď. Vakcína proti podjednotke Rv3131 navyše vyvolala silnú a trvalú pamäťovú reakciu založenú na Th1 (obrázky 2, 3 a 5) a porovnateľný ochranný účinok proti Mtb K na rozdiel od ochrany indukovanej BCG ako očkovanie proti jednej podjednotke Ag 4 Týždne po očkovaní. Infekcia (obr. 4).
Nedávno Zvi a kol. uviedli, že 189 génov z 3 989 produktov ORF genómu Mtb bolo vybraných in silico ako domnelých kandidátov na vakcíny na základe súboru údajov v genómovej škále vytvoreného pomocou rozsiahlej ťažby údajov a bioinformatiky 44. Spomedzi 189 kandidátov na vakcínu, Rv3131 a Rv3127, bol do zoznamu 45 špičkových zásahov zahrnutý ďalší nitroreduktáza kódovaná regulonmi DosR a druhý najvyšší gén v našej štúdii transkripčného profilu. Okrem teoretickej analýzy experimentálne dôkazy naznačujú, že Rv3131 je T-bunkový Ag. Napríklad Rv3131 indukované Mtb-špecifické imunitné reakcie T-buniek boli hlásené u subjektov pozitívnych na tuberkulínový kožný test, ale nie u zdravých kontrol alebo pacientov s TBC 45. Ako ďalší príklad preukázal Rv3131 najimunogénnejší potenciál Ag v porovnaní s ostatnými Ag súvisiacimi s DosR na schopnosť indukovať IFN-y v latentne infikovanej gambijskej populácii 46 .
Stručne povedané, naše súčasné údaje naznačujú, že Rv3131 kódovaný DosR, nový cieľový Ag pre vývoj vakcín proti TBC, má potenciál ako účinná vakcínová Ag splnením nasledujúcich kritérií: konštitutívna a stabilná expresia v hyper-virulentnom Peking Mtb; schopnosť byť rozpoznaný imunitným systémom počas in vivo infekcie; schopnosť indukovať Ag-špecifické, Th1-predpäté multifunkčné T bunky; a účinnosť proti hyper-virulentným kmeňom Mtb. Preto môže byť Rv3131 vynikajúcim kandidátom na použitie vo vakcíne s viacerými antigénmi podjednotky Mtb, najmä vzhľadom na obmedzenú účinnosť vakcíny BCG voči rodine z Pekingu.
Metódy
Zvieratá
Všetky experimenty na zvieratách sa uskutočňovali podľa pokynov a predpisov Kórejského úradu pre kontrolu potravín a liečiv (KFDA). Experimentálne protokoly boli skontrolované a schválené Výborom pre ústavnú starostlivosť a použitie zvierat (číslo povolenia: 2015-0041) Yonsei University Health System (Soul, Kórea). Po schválení pokusov boli samice myší C57BL/6 bez patogénu (SPF) vo veku 6-7 týždňov zakúpené od Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japonsko) a umiestnené za bariérových podmienok v zariadení BSL-3 v spoločnosti Avison Biomedical Research Centrum na Yonsei College of Medicine.
Bakteriálne kmene a produkcia bakteriálnej RNA
Microarray experimenty a analýzy
Mtb oligoarray snímky boli láskavo poskytnuté Dr. Stefan HE Kaufmann (Max Planck Institute for Infection Biology, Berlín, Nemecko). Značenie RNA a hybridizácia poľa sa uskutočňovali tak, ako už bolo opísané 59. Hybridizované podložné sklíčka sa skenovali pomocou mikročipového skenera GenePix 4000B (Axon Instruments, CA, USA) a intenzity škvŕn sa identifikovali a kvantifikovali pomocou softvéru TM4 Microarray Software Suite (//www.tm4.org). Intenzity bodového signálu sa v MIDAS normalizovali pomocou možností algoritmu LOWESS a celkovej intenzity poľa. Pre štatistickú analýzu boli použité štyri biologické replikované polia pre podmienky exponenciálneho rastu a tri biologické replikáty pre hypoxické kultivačné podmienky.
Tvorba BMDM a in vitro infekcia
BMDM sa generovali tak, ako už bolo opísané 61. Po 6 dňoch boli diferencované BMDM infikované Mtb H37Rv a K pri MOI 10 počas 24 hodín.
Potvrdenie expresie rv3131 pomocou qRT-PCR
Celkové Mtb H37Rv a K-RNA sa extrahovali z fázy exponenciálneho rastu pod hypoxiou a Mtb infikovanými BMDM pomocou Trizolu, ako je opísané vyššie. CDNA sa potom syntetizovala pomocou hlavnej zmesi RT & GO (MP Biomedicals, Nemecko) podľa odporúčaní dodávateľa. Po syntéze sa diferenciálna génová expresia medzi Mtb H37Rv a K merala pomocou qRT-PCR, ako už bolo opísané vyššie 62. Stručne, qRT-PCR sa uskutočňovala na systéme PCR v reálnom čase StepOnePlus ™ (Applied Biosystems, CA, USA) s použitím SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Takara Bio Inc., Shiga, Japonsko). qRT-PCR sa uskutočňovala s použitím nasledujúcich sád primérov; rv3131 dopredu, 5'-GTGCCCTAGACCGAATGAAA-3 'a dozadu, 5'-TAGCGCCCACTCCAAATG-3', dosR (rv3133c) dopredu, 5'-AGACATCAAGGGAATGGAGTTG-3 'a dozadu 3 'a dozadu, 5'-CGGGACTTAACCCAACATCTC-3'. Násobná zmena génovej expresie medzi Mtb H37Rv a Mtb K bola vypočítaná pomocou metódy ACAC a pre normalizáciu bola použitá 16S rRNA. Na štatistickú analýzu sa použili tri biologické replikáty.
Expresia a čistenie rekombinantného proteínu Rv3131
Imunizácia myší
Myši C57BL/6 boli imunizované tromi intramuskulárnymi injekciami s odstupom troch týždňov. Každá imunizácia obsahovala 5 ug rekombinantného proteínu Rv3131 s 5 ug GLA-SE (adjuvans glukopyranozyl lipidu) formulovaného v stabilnej emulzii olej vo vode (SE) od IDRI (Infectious Disease Research Institute). GLA-SE láskavo poskytla spoločnosť IDRI (Seattle, WA, USA). Na imunizáciu BCG sa myšiam subkutánne injikoval 2 x 105 CFU BCG Pasteur 1173P2. Kontrolná skupina myší bola imunizovaná iba GLA-SE. Bunky sleziny a pľúc sa odobrali a použili na analýzu imunogenity 4 týždne po poslednej imunizácii.
Mtb infekcia
Štyri týždne po poslednej imunizácii boli adjuvantná kontrola (GLA-SE) a vakcinované myši (BCG, Rv3131/GLA-SE) aerogénne infikované kmeňom Mtb K, ako bolo opísané vyššie 63. Stručne, myši boli vystavené pôsobeniu Mtb K po dobu 60 minút v inhalačnej komore zariadenia na infekciu vzduchu (Glas-Col, Terre Haute, IN) kalibrovaného na dodanie vopred stanovenej dávky. Na potvrdenie počiatočnej bakteriálnej záťaže boli o deň neskôr usmrtené štyri myši a do pľúc každej myši bolo uvoľnených približne 150 životaschopných baktérií.
Meranie cytokínov
Jednotlivé bunky pripravené zo sleziny a pľúc myší infikovaných Mtb alebo imunizovaných myší boli stimulované Rv3131 (5 μg/ml) alebo PPD (2 μg/ml) po dobu 24 hodín pri 37 ° C. PPD láskavo poskytol Dr. Brennan v spoločnosti Aeras (Rockville, MD, USA). Hladiny vylučovaného IFN-y (eBioscience, San Diego, CA), IL-4 a IL-5 (BD Bioscience, San Diego, CA) v supernatante kultúry boli detegované pomocou komerčnej súpravy ELISA podľa pokynov výrobcu.
Titre protilátok v sére
Reakcie IgG1 a IgG2c špecifické pre Rv3131 v sére sa hodnotili tak, ako už bolo opísané 63. Stručne, 96-jamkové doštičky boli naplnené 2. g/ml potiahnutý Rv3131; Ako sekundárna protilátka sa použila protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou (HRP) proti IgG1 (BD Bioscience, San Diego, CA) alebo IgG2c (Southern Biotech, Birmingham, AL). Optické hustoty (OD) sa stanovili pri 495 nm v priebehu 15 minút po ukončení reakcie.
Analýza subpopulácií T buniek
Jednobunkové suspenzie buniek pľúc a sleziny sa pripravili tak, ako už bolo opísané 65. Suspenzie jednotlivých buniek boli najskôr blokované anti-CD16/32 po dobu 15 minút pri 4 ° C. Po pokrytí povrchu bunky súpravou Aqua-Dead-Cell-Kit fixovateľnou LIVE/DEAD ™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), anti-CD3 & konjugovanou s Brilliant Violet 421 (BV421); -Peridín-chlórfyl (PerCP) -Cy5,5-konjugovaný anti-CD4, alofykocyanín (APC) -Cy7-konjugovaný anti-CD8 (BD Bioscience, San Diego, CA), fykoerytrín (PE) -konjugovaný anti-CD44, APC konjugovaná anti-CD127 a fluoresceínizotiokyanátová (FITC) konjugovaná anti-CD62L (eBioscience, San Diego, CA) protilátka po dobu 30 minút pri 4 ° C, pričom sa spočítal každý typ pamäťových T buniek pomocou FACSVerse- Analyzovali sa prietokové cytometre (BD Biosciences) a komerčne dostupný softvér (FlowJo).
Intracelulárne farbenie cytokínmi
Jednobunkové suspenzie imunizovaných a infikovaných myší (2 x 106 buniek) boli stimulované Rv3131 (5 μg/ml) alebo PPD (2 μg/ml) pri 37 ° C po dobu 12 hodín v prítomnosti GolgiStop (BD Bioscience). Bunky sa najskôr premyli PBS, blokovali sa anti-CD16/32 blokujúcou protilátkou pri 4 ° C počas 15 minút a potom sa povrchovo zafarbili fluorochrómom označenými protilátkami proti CD3, CD4, CD8 a CD62L, ako aj LIVE/DEAD TM Fixable Aqua Dead Súprava buniek po dobu 30 minút pri teplote 4 ° C. Ako negatívne kontroly sa bunky zafarbili povrchom vhodným izotypovo zhodným imunoglobulínom (Ig). Bunky sa premyli Cytofixom/Cytoperm (BD Biosciences) 30 minút pri 4 ° C, fixovali sa a permeabilizovali. Bunky sa dvakrát premyli s Perm/Wash (BD Biosciences) a potom sa intracelulárne zafarbili s APC-konjugovaným anti-TNF-a, PE-konjugovaným anti-IFN-y a PE-Cy7-konjugovaným anti-IL-2 (BD Biosciences) pre 30 minút pri 4 ° C Bunky sa premyli pomocou Perm/Wash a potom sa zafixovali pomocou IC Fixation Buffer (eBioscience). Po resuspendovaní v PBS sa bunky analyzovali pomocou prietokového cytometra.
Stanovenie počtu baktérií a histopatologická analýza
Štatistická analýza
Všetky výsledky in vitro sú reprezentatívne pre najmenej tri nezávislé experimenty s konzistentnými výsledkami. Údaje v grafoch sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Údaje z experimentu in vivo sa uvádzajú ako medián s medzikvartilovým rozsahom (IQR). Porovnania medzi vzorkami sa uskutočňovali pomocou nepárového t-testu alebo jednosmernej ANOVA, po ktorom nasledoval Tukeyov viacnásobný porovnávací test, keď sa údaje normálne distribuovali pomocou Prism 5 (GraphPad Software verzia 5, San Diego, CA).
Ďalšie informácie
Ako citovať tento článok: Kwon, KW a kol. Nový vakcínový potenciál Rv3131, predpokladanej nitroreduktázy kódovanej regulonom DosR, proti hyper-virulentnému kmeňu Mycobacterium tuberculosis K. Sci. Rep. 7., 44151; doi: 10.1038/srep44151 (2017).
Poznámka redakcie: Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o nároky na jurisdikciu v publikovaných mapách a inštitucionálne prepojenia.
Ďalšie informácie
Wordové dokumenty
Ďalšie informácie
Poznámky
Odoslaním komentára vyjadrujete súhlas s našimi podmienkami používania a pokynmi pre komunitu. Ak zistíte, že niečo zneužíva alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte to ako nevhodné.