Optimalizácia účinnosti endotelovej diferenciácie ľudských kmeňových buniek pozitívnych na CD133 -

1 Z lekárskej kliniky a polikliniky II Onkologického centra Univerzitného lekárskeho centra Hamburg-Eppendorf Optimalizácia účinnosti endotelovej diferenciácie ľudských pozitívnych kmeňových buniek CD133 Dizertačnú prácu na získanie doktorandského titulu v odbore medicína na lekárskom oddelení Univerzity v Hamburgu, ktorú predložila Estelle Jiongo z Kamerunu v roku 2008.

účinnosti

2 2 Prijaté Lekárskou fakultou Hamburgskej univerzity dňa: Vytlačené so súhlasom Lekárskej fakulty Hamburgskej univerzity Skúšobná komisia, predseda: Skúšobná komisia, 2. recenzent: Skúšobná komisia, 3. recenzent: Prof. Dr. W. Fiedler prof. Dr. H. Kabisch prof. Dr. N. Kroeger

4 4 H PODNIKANIE I SPOLKOVÉ VYHLÁSENIE J ZOZNAM OBRÁZKOV K ZOZNAM SKRATIEK ZOZNAM TABUĽKOV

23 23 ovplyvnené krvotvornými kmeňovými bunkami. Za týmto účelom by sa časť buniek mala vyložiť na pôdu obsahujúcu sklo. Ďalšiu možnosť zvýšenia rýchlosti diferenciácie krvotvorných kmeňových buniek je možné dosiahnuť diferenciáciou morfologicky nediferencovaných buniek obsiahnutých v supernatantoch média. Na otázku, či by sa neadherované bunky endotelovo diferencovali, je potrebné odpovedať nahradením týchto buniek. Ďalším zdrojom endotelových buniek sú CD14 pozitívne monocytárne kmeňové bunky (Fernandez a kol., 2000) a MNC (Murasawa a kol., 2002). Mali by byť izolované z leukaferézy, z buffy coatu a z kostnej drene. Výskum by sa mal obmedziť na kvantifikáciu výsledných endotelových buniek a ich imunohistochemickú charakterizáciu. Všetky tri typy buniek a čerstvo izolované krvotvorné kmeňové bunky by sa mali navzájom porovnať, pokiaľ ide o ich diferenciačné správanie.

24 24 C Materiál a metódy 1 Materiál 1.1 Laboratórne vybavenie Tab. 1: Použité laboratórne zariadenie Zdroj dodávky Názov výrobcu Názov zariadenia, počítacia komora Wertheim Neubauer počítacia komora Eppendorf, Hamburg Reference 10, 100 a 1000 pipiet Forma Scientific, Marietta (USA) Inkubátor inkubátora s plášťom do vody Laboratórna technológia vodného kúpeľa GFL vo vodnom kúpeli, prístroje Burgwedel Heraeus Instruments, Hanau Lamin Air HB 2448 Varifuge 3.2 RS sterilná pracovná stolná odstredivka Laboratórne vybavenie spoločnosti Hirschmann, batéria Pipetus, pipetovacia pomôcka Heilbronn Leica, Solms LEICA DM IRB s fluorescenčným softvérom IM50 Reverzný mikroskop Miltenyi Biotec, zariadenie Bergisch GladicS, Frankfurt Cytospin 2 cytocentrifuga Zeiss, Jena Axioplan Axiovert 25 Phomi 3 fluorescenčný inverzný mikroskop inverzný mikroskop/fluorescenčný inverzný mikroskop mikroskop

25 Spotrebný materiál Tabuľka 2: Spotrebný materiál Zdroj dodávky Becton Dickinson, Franklin Consumables Discardit II Sterilné injekčné striekačky; 5, 10 a 20 ml Lakes (USA) BD Falcon, Heidelberg sterilné jednorazové pipety; 1, 2, 5, 10 a 25 ml doštičky s jamkami na bunkovú kultúru; Multiwell 6, 12, 24 alebo 96 jamkové bunkové sitá, 40 μm centrifugačné skúmavky; 15 a 50 ml Greiner, Frickenhausen Eppendorf, Hamburg Heinz Herenz, Hamburg Millipore, Schwalbach Miltenyi Biotec, Bergisch Tubes: 15 a 50 ml reakčné nádoby; 0,5 a 1,5 a 2,0 ml Pasteurove pipety 230 mm, sklo Steriflip (jednorazová sterilizačná jednotka) MACS Separation Columns LS a MS Gladbach Partec, Münster Paul Marienfeld GmbH & krycie sklá bunkových sít 30 µm Co.KG, Königshofen Lauda slide Sarstedt, Pipetovacie špičky Nümbrecht (10, 100 a 1000 µl) Schott, Mainz Shandon Inc., Pittsburgh (USA) Sklenené papierové filtre pre Cytospin 2 (silné filtračné karty), VWR International, sterilné injekčné filtre 0,45 a 0,22 µm (sterilný dietikon) (Švajčiarsko) filter na striekačky)

26 Chemikálie a lekárske výrobky Tabuľka 3: Použité chemikálie a zdravotnícke výrobky Zdroj dodávok Baxter, Munich Biochrom AG, Berlin Biotest, Dreieich Chemický/lekársky výrobok ACD-A Biocoll Separating Solution (Ficoll) AB-sérum ľudské sérové ​​albumíny (HSA) Cambrex, New Jersey (USA) Sada guľiek EGM-2 Fährhaus Handelsgesellschaft Hamburg Gibco, Karlsruhe Pharma mbh, hydrokortizón (HC) D-PBS fetálne teľacie sérum (FKS) fungizón (amfotericín B) konské sérum (HS) IMDM penicilín-streptomycín-glutamín (100x) trypsín ) Prístavné bioprodukty, ľudský fibronektín (FN) Norwood (USA) JT Baker, Phillipsburg Ethanol Absolute (USA) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach CD133 Cell Isolation Kit, humánne CD14 Micro Beads, humánne MACS BSA Stock Solution R&D Systems, Minneapolis (USA) rhang-1 (rekombinantný ľudský angiopoetín-1) rhang-2 (rekombinantný Ľudský angiopoetín-2) Roztok trypánovej modrej (0,4%) TEBU, Offenbach bfgf (základný rastový faktor fibroblastov) EGF (epidermálny rastový faktor) Flt-3-ligand (Flt-3-l, tyrozínkináza súvisiaca s Fms) ligand)

27 27 HGF (ľudský hepatocytový rastový faktor) IGF-1 (inzulínový rastový faktor-I) IL-8 (interleukín-8 alebo neutrofilný chemotaktický faktor odvodený od monocytov) SCF (faktor kmeňových buniek) SCGF-ß (rastový faktor kmeňových buniek) -beta) VEGF (vaskulárny endoteliálny rastový faktor alebo ľudský rekombinát VEGF165) 1.4 Protilátky na imunofluorescenčnú analýzu Tab. 4: Použité protilátky Ľudské značenie Izotyp Klon Aplikácia Zdroj dodávky Antigén g CD144 - Myš 55-7H1 Immun- BD Pharmingen, (VE- IgG 1 κ histochemistry San Diego (USA) Cadherin) FITC vwf (von- Sheep- - Immun- The Binding Site, Willebrand Anti-histochemistry Birmingham -factor) Human (UK) IgG Secondary Texas Red Goat- - Immun- Jackson Antibodies Anti-histochemistry ImmunoResearch, pre myš CD144 West Grove IgG (USA) (H + L)

28 Zloženie pufrov a média Použité cytokíny a ich koncentrácie Tabuľka 5: Prehľad použitých faktorov a ich koncentrácií Faktory Koncentrácia v získanom zásobnom roztoku (µg/ml) (ng/ml) bfgf 50 1 EGF Flt-3-l HGF IGF IL rhang-1 (Ang-1) rhang-2 (Ang-2) SCF SCGF-ß VEGF koncentrácia základného média a pufre AB-PBS - 8 ml PBS - 2 ml AB-sérum Erylyse Buffer (sterilne filtrované) - 8,29 g NH4Cl (155 mm) -1 g KHCO3 (10 mm) -45,2 mg EDTA (0,1 mM) -1 L H20 EBM ml EGM-2 bazálne médium -10 ml FCS -1 ml penicilín/streptomycín (Pen/Strep) -100 ul amfotericínu B.

29 29 EBM-1-80 ml EGM-2 bazálne médium -20 ml FCS -1 ml penicilín/streptomycín (Pen/Strep) -100 ul amfotericínu B EBM-2-450 ml EGM-2 bazálne médium -50 ml FCS -5 ml penicilín/streptomycín -2 ml rhfgf-bheparínu -500 ul amfotericínu B -500 ul GA-1000 (gentamycín) -500 ul kyseliny askorbovej (AS) -500 ul VEGF -500 ul R3-IGF ul heparínu -500 ul rhegf -200 ul expanzného média hydrokortizónu (EM; sterilne filtrované) -50 ml LBMCM (kultivačné médium pre dlhodobú kostnú dreň. Dexter TM; Acta Haematol. 1979; 62 (5-6):) -500 ul SCGF-ß (10 μg/ml) -250 ul VEGF (10 μg/ml) -250 ul Flt3-l (10 μg/ml) zásobný roztok fibronektínu (na potiahnutie doštičiek): -1 mg fibronektínu (FN) -1 ml sterilnej vody -24 ml PBS MACS pufor -475 ml PBS -12,5 ml ľudského sérového albumínu (HSA) -3 ml aqua citrátu dextrózy A (ACD-A) stop médium (po trypsinizácii) pre endotelové bunky: 20% FCS v bazálnom médiu EGM-2 alebo v super médiu

30 30 LBMCM -400 ml IMDM -50 ml fetálne teľacie sérum (FKS) -50 ml konské sérum (HS) -500 ul hydrokortizónu (HC) zásobný roztok trypsínu: -1 ml trypsínu -9 ml PBS základné médium s prídavkom cytokínov ako diferenciačných médií -LBMCM ako základné médium Tabuľka 6: Prehľad pridaných cytokínov Pridané cytokíny VEGF VEGF + Ang-2 VEGF + bfgf VEGF + EGF VEGF + HGF VEGF + IGF-1 VEGF + IL-8 VEGF + bfgf + EGF VEGF + bfgf + HGF VEGF + bfgf + IGF-1 VEGF + bfgf + IL-8 VEGF + bfgf + Ang-2 VEGF + bfgf + EGF + HGF + IGF-1 + IL-8 - EBM-1 ako základné médium Tabuľka 7: Prehľad použitého Faktory a kombinácie Pridané cytokíny VEGF VEGF + Ang-1 VEGF + Ang-2