Optimalizovaná analýza protokolu hepatálnej steatózy in vivo a in vitro (preložené do nemčiny)
Úvod
Obezita predstavuje rastúci zdravotný problém v rozvinutých aj rozvojových krajinách. Uvádza sa, že jedna z koexistujúcich podmienok 1 bola bežne spojená s nealkoholickým tukom v pečeni (NASH), s prevalenciou v rozmedzí od 30 do 100 percent u pacientov s NASH. Kvôli silnej korelácii medzi tukovou pečeňou a obezitou sa na štúdium zložitých molekulárnych mechanizmov podieľajúcich sa na vývoji NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 široko používajú modely myši s obezitou vyvolanou stravou. Steatóza pečene je najskorším štádiom NAFLD a môže prechádzať k nealkoholickej steatohepatitíde (NASH), cirhóze a nakoniec rakovine pečene 7. Všeobecným cieľom tejto metódy je preto generovanie zvieracích a bunkových modelov steatotických podmienok pečene a poskytnutie podrobných protokolov pre efektívne použitie. a presné meranie lipidov. Tieto modely a merania sú vhodné aj na štúdium ďalších metabolických porúch, ako je inzulínová rezistencia a cukrovka 2. typu.
Pretože obezita je identifikovaná ako jeden z hlavných rizikových faktorov pre NAFLD, na vyvolanie obezity u myší sa používa strava s vysokým obsahom tukov a sacharózy (HFHS), ktorá napodobňuje stravu s vysokým obsahom tukov v západnom štýle. Stupeň steatózy pečene možno potom vyhodnotiť pomocou rôznych metód. Najskôr analýza hmotnosti a zloženia tela pomocou nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR) ukazuje akumuláciu lipidov počas kŕmenia. Tučnú hmotu a svalovú hmotu je možné kvantifikovať neinvazívnym spôsobom a v reálnom čase.
Ďalej sa používa magnetická rezonancia (MRI) na zobrazenie distribúcie tuku v tele a v tele. Signál v odtieňoch šedej z MRI analýzy možno previesť na čitateľný pseudo farebný obraz a intenzita odtieňov šedej a farby sú hemi-kvantifikovateľné. Táto technológia ponúka jedinečné výhody pri meraní akumulácie lipidov u živých zvierat. Po druhé, histologická analýza pečene je najbežnejšou metódou používanou na stanovenie steatózy pečene. Farbenie hematoxylínom a eozínom (H&E) poskytuje histologické údaje, ako je morfológia hepatocytov a infiltrácia makrofágov, zatiaľ čo farbenie olejom Red Red-O ukazuje veľkosť a polohu lipidových kvapiek v hepatocytoch. Po tretie, analýza obsahu lipidov pomocou extrakcie chloroformom/metanolom predstavuje presné a kvantitatívne meranie pečeňových lipidov. Celkové hladiny triglyceridov a cholesterolu je možné merať pomocou biochemických metód. Je dôležité, aby sa analýza extrakcie lipidov a farbenie olejovou červenou O tiež používali v geneticky manipulovaných alebo farmaceuticky ošetrených hepatocytoch.
Výhodou predloženej metódy je použitie viacerých optimalizovaných prístupov na generovanie pečeňových steatotických modelov a komplexnú charakterizáciu fenotypov in vivo aj in vitro. Myšie modely DIO môžu rekapitulovať patológiu a metabolický fenotyp ochorenia pečene ľudí na tuk. V tomto modeli možno replikovať aj ďalšie metabolické parametre u ľudí 8. Generovanie modelu steatotických hepatocytov v reakcii na vysokú hladinu glukózy plus inzulín je efektívne, užitočné a prekonáva obmedzenie nákladného a časovo náročného fungovania myši. Dohromady sú tieto metódy dostatočné a potrebné na vyšetrenie porúch pečeňových lipidov a inzulínovej rezistencie v prípade preťaženia živinami.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
Všetky protokoly o testovaní na zvieratách boli schválené Výborom pre ústavnú starostlivosť a použitie zvierat na Ústave výživy ľudí, Šanghajskom ústave biologických vied, Čínska akadémia vied (Šanghaj, Čína).
2. Primárny myšací model hepatocytov
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Ako v 1A Ako je znázornené, telesná hmotnosť myši sa zvýšila na 45 ± 1,2 g po 16 týždňoch kŕmenia HFHS, čo je asi 1,5-krát vyššia hodnota ako v prípade skupiny s chow-diétou. Uvádzajú sa NMR analýzy telesného zloženia ukazujúce tukovú hmotu a svalovú hmotnosť myší (1B). Distribúcia tuku v celom tele a pečeni bola stanovená pomocou MRI a reprezentatívne pseudobarevné obrázky u myší pri vedomí sú v 1C-D zobrazené. Telesná hmotnosť a zloženie tela sa merali a vizualizovali počas procesu stravovania pomocou HFHS.
Na disekciu steatotických fenotypov boli myši usmrtené a bola vykonaná histologická analýza pečene. Škvrny pečene H&E a olejovej červenej O sú vnútri 2A-B preukázané v lipidových kvapkách väčšie a zaberajúce priestory vo väčšine hepatocytov po 4 mesiacoch stravovania HFHS. Stupeň hepatálnej steatózy HFHS stravovaných myší je možné ľahko vizualizovať porovnaním myší kŕmených Chowovou diétou. Hlavné zložky lipidu, ako je triglycerid a cholesterol, sa extrahovali použitím zmesi chloroform/metanol (2C) merané. U DIO myší nadmerné preťaženie živinami spôsobuje abnormálne hromadenie triglyceridov v pečeni. S údajmi z NMR, MRI a histologickej analýzy bude stupeň lipidovej depozície stanovený efektívne a presne.
Ako v 3 zobrazené, hladiny lipidov v primárnych hepatocytoch boli indukované vysokou glukózou plus inzulín po dobu 24 hodín. Nahromadené lipidové kvapôčky boli indikované olejovým červeným O farbením (3A) a po kvantitatívnej lipidovej analýze nasledovali hladiny triglyceridov a cholesterolu v hepatocytoch (3B) sa používa na meranie stanoveného. Na základe modelu je možné efektívne a rýchlo študovať účinky genetickej modifikácie alebo farmaceutického ošetrenia na lipidovú homeostázu v hepatocytoch.
Diskusia
NASH je séria progresívnych ochorení pečene spojených s metabolickým syndrómom, obezitou, inzulínovou rezistenciou alebo diabetes mellitus 2. typu (T2DM) 11. Charakteristickým znakom NAFLD je steatóza, akumulácia lipidov v hepatocytoch. Tu je predstavené spektrum metód na charakterizáciu fenotypov a parametrov steatózy pečene s použitím DIO myší a myších primárnych hepatocytov. Tento postup by mohol pomôcť objasniť molekulárne mechanizmy NAFLD a iných súvisiacich metabolických porúch.
Analýzy zloženia tela, vrátane NMR a MRI, poskytujú neinvazívne údaje o lipidoch v celom tele a v pečeni v reálnom čase. Jedná sa o neinvazívne, časovo nenáročné, vizualizovateľné a semikvalitatívne meranie. Presnosť analýz zloženia tela sa dá navyše výrazne zlepšiť kombináciou ďalších histologických a biochemických meraní. Je nevyhnutné a nevyhnutné určiť steatózu pečene in vivo a in vitro pomocou farbenia H&E, farbenia olejovou červeno-O a merania lipidov, čo sú všetko zlaté štandardné merania pre diagnostiku a klasifikáciu steatózy pečene.
Jedným z obmedzení predloženej metódy je jej neschopnosť merať zápal a depozíciu kolagénu, keď jednoduchá steatóza postupuje k hepatitíde, fibróze a nakoniec cirhóze a rakovine pečene. Pretože obézne myši vyvolané stravou majú nízke riziko vzniku NASH, je súčasný protokol dostatočný na vyhodnotenie steatózy pečene u DIO myší. Avšak za podmienky NASH by sa mali použiť ďalšie biochemické merania, ako sú hladiny plazmovej alanínaminotransferázy (ALT) a aspartátaminotransferázy (AST).
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Zverejnenie
Autori tvrdia, že nemajú finančné záujmy.
Finančné prostriedky: Táto práca bola podporená z grantov od Čínskej národnej prírodnej nadácie (č. 81270930, 31471129 a 31671224) a Programu stoviek talentov Čínskej akadémie vied (2013OHTP04) spoločnosti YL.