Pokročilý myší model pre nealkoholickú steatohepatitídu v spojení s cukrovkou 2. typu
Zhrnutie
Je opísaný jednoduchý a spoľahlivý model oplotenia pre steatohepatitídu bez alkoholu (NASH) indukovaný diétou, ktorý sa dosahuje umiestnením zvierat bez SPF a podávaním špecifickej stravy s vysokým obsahom tukov. Popisujeme identifikáciu podskupín pečeňových a tukových buniek na rekapituláciu ľudských imunitných podmienok vystavením myší bakteriálnym vplyvom prostredia.
Abstrakt
Obezita bola spojená s chronickým zápalom nízkej kvality a inzulínovou rezistenciou, čo prispieva k zvyšovaniu prevalencie chronických metabolických chorôb, ako je cukrovka typu 2 a steatohepatitída bez alkoholu (NASH). Posledný výskum ukázal, že protizápalové imunitné bunky infiltrujú obézne hypertrofické tukové tkanivo a pečeň. Vzhľadom na objavujúcu sa úlohu imunitných buniek v metabolickej homeostáze je naliehavo potrebné kvantifikovať a charakterizovať ich zmeny vo vývoji cukrovky typu 2 a NASH. Zvieracie modely, ktoré vyvolávajú patofyziologické znaky typické pre ľudský NASH, sú však riedke.
V tomto článku poskytujeme podrobný protokol na identifikáciu podskupín imunitných buniek izolovaných z pečene a tukového tkaniva v spoľahlivom myšom modeli NASH získanom umiestnením myší s vysokým obsahom tukov (HFD) pod nešpecifické patogénne látky (SPF) podmienky bez blokovania najmenej sedem týždňov. Ukazujeme manipuláciu s myšami za neslaných podmienok, trávenie tkaniva a identifikáciu makrofágov, prirodzených zabíjačských buniek (NK), dendritických buniek, podskupín B a T buniek pomocou prietokovej cytometrie. Poskytnuté sú reprezentatívne grafy prietokovej cytometrie od myší SPF-HFD a myší iných ako SPF. Pre získanie spoľahlivých a interpretovateľných údajov je rozhodujúcim prvkom použitie protilátok, presné a presné metódy trávenia potravy a správny druh v experimentoch s prietokovou cytometriou.
Intervencia na obnovenie fyziologickej expozície antigénu u myší umiestnením do iných ako slovanských podmienok a nešpecifická expozícia mikrobiálnym antigénom by mohla byť relevantným nástrojom pri štúdiu vzťahu medzi imunologickými zmenami spôsobenými stravou. Obezita a súvisiace dlhodobé komplikácie.
Úvod
Obezita je multifaktoriálne ochorenie a hlavný rizikový faktor pre vznik srdcových chorôb, mŕtvice, steatohepatitídy bez alkoholu (NASH), cukrovky typu 2 (T2D) a niektorých druhov rakoviny. Prevalencia obezity na celom svete rýchlo rastie. V dnešnej dobe je 2,1 miliardy ľudí - takmer 30% svetovej populácie - obéznych alebo s nadváhou 1. Obézna inzulínová rezistencia môže viesť k T2D, keď vyčerpané beta bunky pankreasu nedokážu kompenzovať zvýšenú potrebu inzulínu na udržanie homeostázy glukózy 2.
Tukové tkanivo je tvorené rôznymi typmi buniek, vrátane adipocytov, endotelových buniek, fibroblastov a imunitných buniek. Počas progresie obezity môžu zmeny v počte a aktivite imunitných buniek viesť k horšiemu zápalu hypertrofického tukového tkaniva 3, 4. Konkrétne sa zistilo, že nadmerný príjem energie sprevádzaný chronicky zvýšenou hladinou cukru v krvi, triglyceridmi a voľnými mastnými kyselinami vedie k hypoxii adipocytov, endoplazmatickému retikulárnemu stresu, narušeniu mitochondriálnych funkcií a zvýšenej sekrécii cytokínov, čo vedie k aktivácii protizápalových tukových buniek 5,6. Doterajší výskum sa zameral predovšetkým na vrodenú imunitu, ale v poslednej dobe sa adaptívne imunitné bunky (T a B bunky) ukázali ako dôležité regulátory homeostázy glukózy. Majú zápalové funkcie (vrátane CD8 + T buniek, Th1 a B buniek) alebo predovšetkým regulačné funkcie (vrátane regulačných T (Treg) buniek, Th2 buniek) a môžu jednak zhoršovať, jednak chrániť inzulínovú rezistenciu 7,8. ., 9. september
Na štúdium rôznych podskupín imunitných buniek v tukovom tkanive a pečeni pri vývoji inzulínovej rezistencie a NASH na pokročilom myšom modeli, ktorý reprodukuje ľudské imunitné podmienky, sa myši umiestnili do jednotlivých klietok v semi-sterilných podmienkach bez bariéry. U myší, ktoré boli chované v podmienkach vystavených antigénu, sa vyvinula patológia pečene podobná NASH už po 15 týždňoch diéty s vysokým obsahom tukov (HFD). V porovnaní s SPF myšami primeranými veku sa u nich vyvinula makrovezikulárna steatóza, infiltrácia pečene a aktivácia imunitných buniek.
Tento rukopis popisuje rozsiahlu prietokovú cytometrickú analýzu s cieľom definovať a spočítať podmnožiny imunitných buniek z tukového tkaniva a pečene myši na modeli NASH. Analýza prietokovou cytometriou umožňuje stanovenie viacerých parametrov jednotlivých buniek súčasne na rozdiel od RT-PCR alebo imunohistochemických prístupov.
Stručne povedané, naša štúdia poskytuje myší model krátkodobej HFD na štúdium vývoja inzulínovej rezistencie a NASH a základných mechanizmov, ktoré tiež preukazujú vernosť ľudskému stavu.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
Táto štúdia bola vykonaná v súlade s Sprievodcom národnými zdravotníckymi ústavmi pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat a zákonom o dobrých životných podmienkach zvierat pod dohľadom nášho inštitucionálneho výboru pre dobré životné podmienky zvierat. Protokoly o zvieratách sa uskutočňovali v súlade s inštitucionálnymi etickými usmerneniami Charité Berlin a boli schválené Štátnym úradom pre zdravie a sociálne veci a zodpovedajú pokynom ARRIVE.
1. Zvierací model steatohepatitídy vyvolaný stravou
2. Príprava činidiel a roztokov
3. generácia jednobunkových suspenzií
5. Kompenzácia, získanie a hradlo prietokovej cytometrie
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Reprezentatívne výsledky extracelulárneho farbenia T buniek v myšej pečeni myší vystavených HFD sú uvedené na obrázku 3 A. detekovaná v porovnaní s HFD SPF myšami. V skutočnosti je možné u myší exponovaných HFD detekovať vyššie percento efektorových zásob CD4 + a CD8 + T buniek, zatiaľ čo intrahepatálne naivné CD4 + a CD8 + T bunky boli pri expozícii významne nižšie v porovnaní s SPF myšami. 7. týždeň (obrázok 3 A).
Na overenie týchto výsledkov sa pečeňová zápalová odpoveď spojená s expozíciou antigénu skúmala farbením pečeňových rezov od myší kŕmených 15 týždňov 13. U myší vystavených HFD bola zistená závažná steatóza vrátane nárastu veľkých lipidových kvapôčok vedúcich k makrovezickej steatóze, zápalu lobelie, hepatocelulárnemu balónovaniu a narušenej lobulácii, zatiaľ čo iba niektoré myši SPF vykazovali miernu akumuláciu tuku v pečeni (obrázok 3)B). Ako na obrázku3Hlásené C., podiel NK buniek v perigonadálnom tukovom tkanive myší exponovaných HFD bol vyšší, zatiaľ čo myši HFD-SPF vykazovali vyšší podiel dendritických buniek. Nezistili sa žiadne významné rozdiely pre makrofágy a monocyty. Celkovo tieto výsledky potvrdzujú závažnejšiu steatózu pečene u myší exponovaných HFD a menšie rozdiely v tukovom tkanive medzi myšami exponovanými HFD a SPF.
stôl 1 ukazuje protilátky použité v tabuľke 1. Protilátky používané v analýze prietokovou cytometriou na extraekulárne farbenie B buniek, makrofágov, NK buniek, dendritických buniek a granulocytov sú v Tabuľka 2zobrazené.
Obrázok 1 : Schematické znázornenie hradlovacej stratégie použitej pri analýze obezity prietokovou cytometriou (tabuľka 1). Najprv sa bunky uzavrú na singletoch. Potom sa nečistoty eliminujú použitím oblasti predného rozptylu (FSC-A) a oblasti bočného rozptylu (SSC-A) a výberu správnej veľkosti. Bunky sú tiež charakterizované expresiou CD45. Životaschopné bunky sa vyberú so markerom živých/mŕtvych buniek, farbivom reagujúcim s amínom, ktoré nie je určené pre živé bunky, ale je určené pre bunky s narušenými membránami. T bunky boli rozdelené na cytotoxické T bunky (CD8 +) a T pomocné bunky (CD4 +) a rozdelené na naivné (CD44 + CD62L-), centrálne úložisko (CD44 + CD62L +), efektorové úložisko (CD44 + CD62L-) a efektorové (CD44 - CD62L +) T bunky. Nakoniec sa bunky CD44 + vrátia do brán KLRG1, CD127 a PD-1. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
obrázok 2 : Schematické znázornenie hradlovacej stratégie použitej pri analýze prietokovej cytometrie tukových buniek (Panel 2). Dendritické bunkové vrátanie bolo založené na expresii CD11b a CD11c. Boli definované nasledujúce ďalšie populácie: B bunky, NK bunky, makrofágy, monocyty a granulocyty. Dáta boli po získaní analyzované pomocou vhodného softvéru. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
obrázok 3 Obrázok: Reprezentatívna prietoková cytometrická analýza T buniek izolovaných z myšieho perigonadálneho tukového tkaniva a pečene. (A.) CD4 + a CD8 + T bunky z myšej pečene od 7 týždňov u HFD myší chovaných pod SPF a vystavené podmienky sa analyzovali prietokovou cytometriou. B.) reprezentatívne sfarbenie 15 týždňov HFD SPF a exponovaných myší. Infiltrácia imunitných buniek a hepatocytov vlákniny (šípky) ilustruje NASH. C.) Podiel vrodených imunitných buniek obezity ako percento leukocytov u HFD myší držaných pod SPF alebo vystavených podmienkam po dobu 7 týždňov. n = 6 - 10 myší na skupinu. Významnosť sa stanovila pomocou obojsmerných viacnásobných meraní ANOVA. Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM. * * P <0,01, * * * P 13 zmenené. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
Steatohepatitída má silné spojenie s metabolickými poruchami, ako je obezita, inzulínová rezistencia a dyslipidémia 15. Niekoľko štúdií naznačuje, že zápal tukového tkaniva môže viesť k patogenéze cukrovky typu 2, vrátane zmeneného počtu buniek vrodeného aj adaptívneho imunitného systému 4, 5, 16, 17. Okrem toho sa zistilo, že obezita moduluje aktiváciu imunitných ciest, čo môže viesť k komplikáciám pečene 18. Záujem o charakterizáciu fenotypov imunitných buniek pri obezite a zápaloch pečene rastie, pretože každá subpopulácia imunitných buniek prispieva inak k rozvoju inzulínovej rezistencie a steatohepatitídy.
Táto metóda poskytuje podrobné informácie o tom, ako izolovať a kvantifikovať relatívne množstvo imunitných buniek z perigonadálneho tukového tkaniva a pečene. Metódy navyše ukazujú, ako môžu byť myši kŕmené HFD udržiavané za iných ako mokrých podmienok, aby sa vyvolala steatohepatitída. Protokol je možné použiť na štúdium funkcií imunitných buniek a na štúdium spojení špecifických imunitných buniek medzi rôznymi tkanivami v mikrobiologicky normalizovanom prostredí.
V našej súčasnej štúdii malo za následok HRFD kŕmenie myší bez sepF vývoj inzulínovej rezistencie a steatohepatitídy, zatiaľ čo u HFD SPF myší sa vyvinula inzulínová rezistencia, mierna steatóza pečene, ale žiadna steatohepatitída stanovená imunohistochemicky. Podskupiny tukov a plesní pečene sa navyše významne líšili medzi myšami exponovanými HFD a SPF, čo potvrdzuje naše chápanie dôležitosti rôznych životných podmienok. V súhrne sme boli schopní preukázať, že mikrobiálna expozícia komunite môže dramaticky ovplyvniť imunologické vlastnosti myší C57Bl/6. Predchádzajúce práce ukázali, že rozmanitosť a funkcia črevného mikrobiómu je ovplyvnená obezitou spôsobenou stravou 19, 20 a že funkcia črevnej bariéry a črevná priepustnosť závisia od životných podmienok 21. V pripravovanej publikácii sa chceme zaoberať vzťahom medzi kolonizáciou čreva a zápalom tukov a pečene.
Pri plánovaní navrhovaných metód je potrebné vziať do úvahy niekoľko bodov. Najskôr všetky testy prietokovej cytometrie vyžadujú jednobunkové suspenzie a životaschopnosť buniek môže byť ovplyvnená stupňom mechanickej disociácie tkaniva a dĺžkou trávenia tkaniva. Aby sa zabránilo deštrukcii ebegitopu protilátky a maximalizoval sa výťažok funkčne životaschopných, disociovaných buniek, je potrebné brať do úvahy typ tkaniva, vek zvieraťa, genetické zmeny, koncentrácie enzýmov, teplotu a inkubačné doby.
Po druhé, náš protokol bol optimalizovaný na kvantifikáciu rôznych fenotypov nárazových buniek od obéznych myší kŕmených HFD so zápalom tukového tkaniva a steatohepatitídou. Pretože počet imunitných buniek, počet imunitných buniek a tým aj kvalita trávenia tkaniva môžu byť ovplyvnené zápalovými procesmi, mal by sa použitý protokol a kolagenáza v určitých experimentoch optimalizovať pre iné tkanivá ako pečeň alebo tukové tkanivo. Čo sa týka metód disekcie, inkubačných časov alebo kolagenázy použitej na trávenie tkaniva. Po tretie, pre protokol je dôležité, aby sa každý deň zúčastňovali rôzne experimentálne skupiny, aby sa eliminovali účinky denných zmien v teste prietokovej cytometrie (teplota, inkubačné časy atď.).
Na záver poskytneme podrobný protokol pre fenotypovú charakterizáciu myšej adipózy a pečeňových imunitných buniek pomocou prietokovej cytometrie na modeli NASH a inzulínovej rezistencie vyvolanom stravou. Vzhľadom na komplexnú funkciu a reguláciu vrodených a adaptívnych buniek spojených s obezitou a metabolickou dysreguláciou by naše navrhované metódy mali pomôcť prehĺbiť naše chápanie imunologických mechanizmov na vyváženie metabolickej homeostázy. A tak pomôžte vyvinúť humánne terapeutiká, ktoré môžu obnoviť protizápalové imunitné reakcie. Dodaný zvierací model celkovo slúži ako rýchly a robustný model na hodnotenie metabolických komplikácií spojených s obezitou a možno ho použiť na ďalšie modely chorôb.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.