Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C.

Zhrnutie

Táto práca popisuje semi-high-throughput protocol, ktorý umožňuje simultánne 3D časozberné zobrazenie embryogenézy pri 80–100 embryách C. elegans v jednej nočnej prevádzke. Zahrnuté sú aj nástroje na spracovanie a vizualizáciu obrazu na optimalizáciu analýzy údajov. Kombinácia týchto metód s upravenými reportérovými kmeňmi umožňuje podrobné sledovanie embryogenézy.

Abstrakt

Úvod

Embryo C. elegans je dôležitý modelový systém pre mechanistickú bunkovú biológiu a analýzu špecifikácie osudu buniek a morfogenetických udalostí, ktoré riadia embryonálny vývoj 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. Doteraz sa veľká časť charakterizácie oboch udalostí na bunkovej úrovni a špecifikácií bunkového osudu v embryu dosiahla pomocou experimentov s relatívne vysokým časovým rozlíšením pomocou fluorescenčných markerov. Aj keď tento prístup funguje dobre pre udalosti rádovo od sekúnd do desiatich minút, stáva sa technicky limitujúcim pre charakterizáciu dlhších procesov v poradí od hodín po dni. Embryonálny vývoj od prvého štiepenia po koniec naťahovania trvá asi 10 hodín. V tomto časovom horizonte by metódy s polovičnou priepustnosťou, ktoré by umožnili simultánne zobrazovanie väčších skupín embryí z rôznych podmienok s nižším časovým rozlíšením (t. J. Získanie v časových intervaloch 5-20 minút), otvorili nový súbor experimentov; z. B. umožnenie systematického rozsiahleho skríningového úsilia a analýza dostatočného počtu embryí na porovnanie následkov molekulárnych porúch.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

1. Pripravte embryá C. elegans na vysoko výkonné zobrazovanie

POZNÁMKA: Cieľom tejto časti protokolu je generovať populáciu semi-synchronizovaných embryí C. elegans (v štádiu 2 až 8 buniek), ktoré sú disekované príslušnými markerovými kmeňmi (obrázok 2).) do sklenenej doštičky s 384 jamkami na zobrazovanie. Môžu fungovať aj iné formáty doštičiek, ale uprednostňujú sa 384 doštičky s doštičkami, pretože malá veľkosť jamky obmedzuje šírenie embryí na relatívne malú plochu, čo uľahčuje identifikáciu polí obsahujúcich viac embryí pre časozberné zobrazovanie. Približná synchronizácia embryí zaisťuje, že je zaznamenaný celý proces vývoja každého z embryí v poli.

2. Bodovanie embryonálnej letality

Na základe naskenovaných polí sa hodnotí embryonálna letalita a chyby lariev spočítaním vyliahnutých červov a nevyliahnutých embryí pre každú jamku.
Dosiahnite nevyliahnuté embryá ako zárodok. Vylúčte jedno- až štvorbunkové embryá zo skóre úmrtnosti, pretože mladé disekované embryá niekedy nedokážu dokončiť tvorbu vaječných škrupín (ak meióza II ešte nie je úplná) a defekty permeability môžu viesť k osmotickým komplikáciám v prvých dvoch rokoch. Obchodné oblasti.
Skóre čiastočne vyliahnutých alebo úplne vyliahnutých červov s morfológiou tela alebo poruchami správania, ako sú knedlíky alebo paralyzovaní, označte ako „abnormálnu larvu“.

3. Automatické orezávanie (obrázok 3A.)

POZNÁMKA: Softvér je umiestnený na dvoch miestach: (1) Zenodo obsahuje užívateľsky príjemnú verziu softvéru 12, ktorá nevyžaduje žiadne znalosti programovania. (2) Github obsahuje zdrojový kód pre náš softvér embryoCropUI.py a screenCrop.py 13, ktorý vyžaduje znalosť jazyka Python. Podrobné pokyny na stiahnutie a používanie oboch verzií programu sú uvedené nižšie.

4. Vizualizácia (obrázok 4)

POZNÁMKA: OpenandCombine_embsV2.ijm 10, 12 je makro ImageJ, ktoré vytvára ľahko rozpoznateľný súbor tiff zo všetkých obrázkov pre konkrétny úsek a podmienky. Vyžaduje sa inštalácia FIJI/ImageJ 14, 15. Toto makro sa vykonáva podľa našej štruktúry súborov. Aby bolo možné pracovať s rôznymi štruktúrami súborov, je potrebné ho zmeniť. Pokyny na správnu štruktúru súborov a podrobný popis dôležitých úvah nájdete na konci Súbor GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx v úložisku Zenodo. Pred zobrazením správneho pomenovania a štruktúrovania obrázkov si prečítajte tieto pokyny úplne, aby ste dosiahli čo najlepšie rozhranie s týmto makrom. Naša štruktúra umiestnenia súboru vyzerá takto:
Z: -prispôsobený, Target'Strain'Emb'Target_Emb'_15-miestny jedinečný identifikátor _W '# F_T' #_ Z '#_ C'.tif
napr. Z: -cropped-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Hlavnou výzvou pri charakterizovaní účinku molekulárnych porúch na embryonálny vývoj C. elegans je to, že trvá približne 10 hodín, kým embryá prejdú z prvého štiepenia na koniec natiahnutia pri 20 ° 16. Prístup s polovičnou výkonnosťou, ktorý umožňuje súčasné zobrazovanie veľkých skupín embryí, je užitočný pre udalosti v tomto časovom rámci, pretože umožňuje paralelné mapovanie viacerých podmienok s dostatočnou veľkosťou súboru pre každú podmienku, čo umožňuje kvantitatívnu analýzu (obrázok 1)A.).

Obrázok 2. Vlastné kmene generované na zobrazovanie embryogenézy C. elegans s vysokým rozlíšenímboli. (A.) Schémy ilustrujú transgény použité na konštrukciu kmeňov zárodočnej vrstvy (hore) a morfogenézy (dole). (B.) Projekčné povrchy s maximálnou intenzitou ukazujú vývojový čas v morfogenéze kmeňov (hore) a zárodočnej vrstve (dole). Ventrálny pohľad je znázornený na schémach zapojenia (vľavo). Čas je relatívny k desatinnej čiarke (t = 0), ktorá je ľahko identifikovateľná v oboch kmeňoch. Mierka = 10 m. Obrázok so súhlasom Wang a kol. 10 reprodukovaných. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 3. Program na vlastné orezanie izoluje a orientuje jednotlivé embryá zo zobrazovacích polí. (A.) Schéma ilustruje vlastnosti vlastného programu na orezávanie embryí a zdôrazňuje dve možnosti prístupu k tomuto programu: užívateľsky prívetivé grafické rozhranie, ktoré nevyžaduje žiadne znalosti programovania a je založené na programe Zenodo (vľavo) a dávkovej orezávaní programu, Pythonu Vyžaduje skúsenosti a je k dispozícii na Github (vpravo). (B.) Grafika sumarizuje algoritmus automatického orezávania - z 8-bitových obrazov svetlého poľa sa generuje binárna maska a jednotlivé embryá sa rozpoznávajú, vyrezávajú a zarovnávajú pozdĺž prednej zadnej osi. Mierka je 10 m. (C.) Schematický opis procesu použitého na iteratívne rozpoznávanie embryí v binárnej maske. (D.) Schematicky ilustruje metódu orientácie embryí pozdĺž predozadnej zadnej osi. Panely B-D reprodukované so súhlasom Wang a kol. 10. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 4. Vlastné makro ImageJ umožňuje vizualizáciu údajov skríningu RNAi generovaním zložených súborov pre každú podmienku. (A.) Embryá pre tri príklady podmienok RNAi z testovacej súpravy pre 40 génov (celý súbor údajov pozri Wang et al. 10, 11) sú zobrazené (vpravo), pričom zvýrazňujú rôzne podpisové fenotypy, ktoré sú spoločné pre každého, a reprodukovateľnosť. fenotypy v rámci každej podmienky. Panel bol vyrobený so súhlasom Wang a kol. 10 prispôsobené. (B.Ovládací panel zobrazuje, ako vlastné makro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm) vytvára embryá zo špecifického stavu RNAi do zloženého súboru ImageJ, ktorý nastavuje projekcie jasného poľa a maximálnej intenzity pre každé embryo v každom okamihu. Aj keď je zvýraznený iba jeden príklad, toto makro môže kompilovať údaje pre mnoho podmienok RNAi súčasne. Makro ImageJ je k dispozícii na Zenodo 12. Mierka = 10 m. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tejto ilustrácie.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Metóda filmu s vysokou priepustnosťou spolu s tu opísanými nástrojmi na orezávanie a spracovanie obrazu uľahčí analýzu embryonálneho vývoja C. elegans s rôznymi mutantmi, poruchami a markerovými kmeňmi. V súčasnosti v našom vlastnom laboratóriu prebieha veľkoplošná obrazovka, pomocou ktorej sa pomocou týchto metód natáčajú embryá z dvoch tu opísaných kmeňov na mieru potom, čo sa vyvinul 2 000 génov. Údaje z týchto snáh budú nakoniec slúžiť ako ďalší zdroj na zvýšenie úsilia o pochopenie špecifikácie bunkového osudu a morfogenetických udalostí počas embryogenézy.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.