Štúdium replikačnej starnutia psích dermálnych fibroblastov ako príspevok k

Z Veterinárneho anatomického ústavu Veterinárnej lekárskej fakulty Univerzity v Lipsku Vyšetrovanie replikačnej starnutia psích dermálnych fibroblastov ako príspevku k výskumu starnutia Úvodná dizertačná práca na získanie titulu Doctor medicinae veterinariae (Dr. med.vet.) Veterinárna lekárska fakulta Univerzity v Lipsku predložila Susanne Streit z Halle/Saale Leipzig, 2006

starnutia

So súhlasom Veterinárnej fakulty Univerzity v Lipsku dekan: Prof. Dr. Karsten Fehlhaber Vedúci: Prof. Dr. med. veterinár. habil. Recenzent Franz-Viktor Salomon: 1. Prof. Dr. med. veterinár. habil. Inštitút veterinárnej anatómie Franza-Viktora Salomona, Fakulta veterinárneho lekárstva, Univerzita v Lipsku 2. Dr. rer. nat. habil. Ulf Anderegg Katedra experimentálnej dermatológie Univerzitná kožná klinika Lipská univerzita Lipsko 3. Prof. Dr. DR. h.c. Wilfried Kraft I. Lekárska veterinárna klinika, Oddelenie veterinárneho lekárstva, Univerzita Ludwiga Maximiliána, Mníchov Deň obrany: 19. decembra 2005

Obsah 1 Úvod 1 2 Prehľad literatúry 3 2.1 Starnutie 3 2.1.1 Definície pojmu starnutie 3 2.1.3 Priemerná a maximálna dĺžka života 4 2.1.4 Starnutie rôznych druhov 4 2.1.5 Priemerná dĺžka života druhov psov (Canis familiaris) 6 2.1.6 Účinky starnutia na druhy psov 9 2.2 Výskum starnutia 11 2.2.1 Teórie starnutia 11 2.2.2 Úrovne starnutia podľa HAYFLICK (1985) 12 2.2.2.1 Teórie orgánov 12 2.2.2.2 Fyziologické teórie 12 2.2.2.3 Teórie založené na genóme 13 2.2.3 Bunková starnutie 14 2.2.4 Používanie fibroblastov na experimenty in vitro 17 2.2.5 Správanie sa fibroblastov in vitro a vzťah k maximálnej a priemernej dĺžke života druhu, veku darcu a zdravotnému stavu darcu 17 2.2.6 Stanovenie parametrov replikatívneho materiálu Starnutie 20 2.2.7 Psy vo výskume starnutia 21 2.2.8 Predĺženie životnosti 22 3 Zvieratá, materiál, metódy 24 3.1 Testovacie zvieratá 24 3.2 Materia záložné právo 25 3.2.1 Použité chemikálie 25 3.2.2 Pufre a roztoky 26 3.3 Metódy 27 3.3.1 Bunková kultúra 27 3.3.1.1 Materiál vzorky 27 3.3.1.1.1 Odber vzorky 27 3.3.1.1.2 Príprava vzorky 27

3.3.1.2 Kultivácia buniek 28 3.3.1.2.1 Podmienky kultivácie 28 3.3.1.2.2 Zmena média 28 3.3.1.2.3 Subkultivácia 28 3.3.1.2.4 Počítanie buniek a farbenie trypánovou modrou 29 3.3.1.2.5 Zmrazenie buniek 29 3.3.1.2. 6 Rozmrazovanie buniek 29 3.3.1.2.7 Vytváranie rastových kriviek 30 3.3.2 Cytologické a imunocytochemické vyšetrenia 30 3.3.2.1 Azanové farbenie podľa Heidenhaina 30 3.3.2.2 Giemsovo farbenie 31 3.3.2.3 Detekcia mykoplazmy pomocou fluorescenčnej analýzy 31 3.3.2.4 Imunohistochémia 32 3.3. 3 Fotografická dokumentácia 33 3.3.3.1 Fotografovanie živých buniek 33 3.3.3.2 Fotografovanie vytvorených bunkových škvŕn 34 3.3.3.3 Meranie fotografovaných buniek 34 3.3.3.4 Štatistická analýza a diagramy 34 3.4 Výpočet parametrov bunkovej kultúry 34 4 Výsledky 36 4.1 Predbežné testy 36 4.2 Morfológia kultivované bunky 37 4.3 Fluorescenčná analýza 41 4.4 Imunohistochémia 42 4.5 Proliferačné parametre kultivovaných buniek 43 4.5.1 Celkový počet a vitalita buniek d eršie bunkové kultúry 43 4.5.2 Nastavenie proliferácie 46 4.5.3 Rastové krivky 48 5 Diskusia 55 5.1 Kritika metodiky 55 5.1.1 Výber testovaných zvierat 55 5.1.2 Realizácia experimentu 57 5.2 Zmysluplnosť kultivačných systémov všeobecne a najmä 60

6 Zhrnutie 72 7 Zhrnutie 74 8 Bibliografia 76

Zoznam použitých skratiek ABC komplex BSA CPDL DAB DAPI DMEM DMSO DNA EDTA a kol. FBS GSF HPDL IVL PBS PCR PDL PFA RNA TBS Tris Tris-HCl CNS Streptavidín-Biotínový komplex Streptavidín-Biotínový komplex Kumulatívna populácia zdvojnásobujúca hladinu 3,3'-diaminobenzidín-tetrahydrochlorid 4 ', 6-diaminid-2'-fenyindol-dihydrochlorid Dulbecco Modifikované médium Eagle Dimetylsulfoxid deoxyribonukleová kyselina, deoxyribonukleová kyselina etyléndiamíntetraoctová kyselina et alii a ďalšie fetálne hovädzie sérum Výskumné centrum pre životné prostredie a zdravie v združení Helmholtz Najvyššia úroveň zdvojnásobenia populácie In vitro životnosť fosfátom pufrovaný soľný roztok, fosfátom pufrovaný soľný roztok polymerázy, polymeráza Reťazová reakcia Obyvateľstvo Úroveň zdvojnásobenia Paraformaldehyd ribonukleová kyselina, ribonukleová kyselina Tris pufrovaný soľný roztok, Tris pufrovaný soľný roztok Tris (hydroxymetyl) aminometán Tris hydrochlorid normálne kozie sérum

Problematická produkcia fibroblastov, nízke kultivačné požiadavky a vysoký potenciál delenia týchto buniek predstavujú značnú výhodu oproti iným bunkovým typom (PEACOCKE a kol. 1991, SMITH a kol. 1984). Cieľom tejto práce bolo skúmanie možných súvislostí medzi vekom zvieraťa a proliferatívnym správaním jeho buniek (kožné fibroblasty) (v rámci psieho plemena Beagle). Na tento účel boli založené primárne a sekundárne bunkové kultúry psích dermálnych fibroblastov rôzneho veku. Parametre ako úroveň zdvojnásobenia populácie (PDL), kumulatívna úroveň zdvojnásobenia populácie (CPDL), najvyššia úroveň zdvojnásobenia populácie (HPDL), doba generovania a dĺžka života in vitro (IVL) popisujú replikačný potenciál kultivovaných buniek. Pomocou týchto parametrov sa bunkové kultúry mladých, dospelých a starých zvierat navzájom porovnávali. Výsledky tejto práce predstavujú možný základ pre ďalší výskum bunkového starnutia u psov pomocou modelov in vitro