Tilman Graulich
Stereol. Vyšetrovanie d. Pľúca a priedušnica b. d. tumor-kach. Myš VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890 [email protected] www.doktorverlag.de ISBN: 978-3-8359-6616-1 9 7 8 3 8 3 5 Tilman édition scientifique VVB LAUFERSWEILER VERLAG Tilman Graulich Stereologické vyšetrenia oblasti výmeny plynov v pľúcach a inervácie priedušnice v kachektickej myši nádoru Úvodná dizertačná práca na získanie doktorátu na Lekárskej fakulte Univerzity Justusa Liebiga v Giessene 9 6 6 1 6 1 édition scientifique VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG
Dielo je chránené autorskými právami vo všetkých jeho častiach. Právna zodpovednosť za celý obsah tejto knihy spočíva výlučne na autorovi tejto práce. Akékoľvek použitie nie je povolené bez písomného súhlasu autora alebo vydavateľa. To platí najmä pre reprodukcie, preklady, mikrofilmovanie a ukladanie a spracovanie v elektronických systémoch. 1. vydanie 2017 Všetky práva vyhradené. Žiadna časť tejto publikácie sa nesmie reprodukovať, ukladať v systéme vyhľadávania alebo prenášať v akejkoľvek podobe alebo akýmikoľvek prostriedkami, elektronicky, mechanicky, fotokopírovaním, nahrávaním alebo inak, bez predchádzajúceho písomného súhlasu autora alebo vydavateľov. 1. vydanie, 2017, VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Vytlačené v Nemecku édition linguistique VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890 email: [email protected]
Stereologické vyšetrenia oblasti výmeny plynov v pľúcach a inervácia priedušnice v kachektickej myši nádoru NESPRÁVNE ZATVORENIE pre získanie titulu doktora medicíny na Lekárskej fakulte Univerzity Justusa Liebiga v Giessene prezentované Tilmanom Graulichom z Bochum Hannover 2017
Z Ústavu pre anatómiu a bunkovú biológiu Lekárskej fakulty Univerzity Justusa Liebiga v Giessene Výkonný riaditeľ: Prof. Evelyne Baumgart-Vogt 1. recenzent: Prof. Dr. Mühlfeld, 2. recenzent: Prof. Dr. Weißmannov sporný deň: 04.09.2017 II
Obsah Strana 1. Zoznam skratiek VI 2. Zoznam obrázkov VIII 3. Zoznam tabuliek IX I. Úvod 1 I.1. Anatómia dolných dýchacích ciest 1 I.1.1. Funkcia a metabolizmus povrchovo aktívnej látky 4 I.2. Inervácia dýchacích ciest 6 I.3. Pľúca v podvýžive a anorexii 7 I.4. Kachexia nádorov 9 I.5. Nádorová kachexia a dolné dýchacie cesty 10 I.6. Cieľ práce 11 II. Materiál a metódy 12 II.1. Pokus na zvieratách 12 II.2. Príprava a odber vzoriek 12 II.2.1. Odber vzoriek na mikroskopiu 12 II.2.2. Bronchoalveolárna laváž (BAL) 13 II.3. Príprava vzoriek 13 II.3.1. Odber vzoriek na mikroskopiu 13 II.3.1.1. Príprava vzoriek pre svetelnú mikroskopiu 14 II.3.1.2. Príprava vzoriek na imunohistochémiu 15 II.3.1.3. Príprava vzoriek pre elektrónovú mikroskopiu (EM) 17 II.3.1.3.1. Príprava vzoriek pre konvenčnú transmisnú elektrónovú mikroskopiu (TEM) 17 II.3.1.3.2. Príprava vzoriek na imunoelektrónovú mikroskopiu (predpríprava) 18 II.3.1.3.3. Príprava vzoriek pre skenovací elektrónový mikroskop (SEM) 19 II.3.2. Stereológia 19 III
II.3.2.1. Zväzky 21 II.3.2.2. Povrchy 23 II.3.2.3. Dĺžky 24 II.3.3. Príprava vzoriek na diferenciálnu centrifugáciu 26 II.4. Štatistika 26 III. Výsledky 27 III.1. Telesná hmotnosť a objemy pľúc 27 III.2. Mikroskopia 27 III.2.1. Kvalitatívna mikroskopia 27 III.2.1.1. Svetelná mikroskopia 27 III.2.1.2. Imunofluorescenčná mikroskopia 30 III.2.1.3. Tracheálny epitel v 33 rastrovacej elektrónovej mikroskopii (SEM) III.2.1.4. Kvalitatívna transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) 34 III.2.2. Kvantitatívna mikroskopia alebo stereológia 35 III.2.2.1. Pľúca 35 III.2.2.1.1. Objem oblasti výmeny plynov/parenchýmu 35 III. 2.2.1.2. Alveolárny povrch 36 III. 2.2.1.3. Alveolárne epiteliálne bunky typu II 36 III. 2.2.1.4. Vzťah LB k alveolárnemu epitelu 37 III. 2.2.2. Trachea 38 III. 2.2.2.1. Inervácia 38 III. 2.2.2.2. Zloženie tracheálnej steny 39 III.3. Diferenciálna centrifugácia na stanovenie povrchovo aktívnej látky 41 IV. Diskusia 42 IV.1. Použitá metodika 42 IV.1.1 Príprava experimentu, vzorkovanie, fixácia 42 IV.1.2. Stereológia 46 IV.1.2.1. Odber vzoriek 46 IV
IV.1.2.2. Referenčné objemy 47 IV.1.2.3. Testovacie systémy v stereológii 48 IV.1.2.4. Orientácia tkaniva 50 IV.1.3. Imunohistochémia 51 IV.2. Diskusia o výsledkoch 52 IV.2.1. Alveolárny povrch 52 IV.2.2. Metabolizmus povrchovo aktívnych látok 58 IV.2.3. Rozbor krvi 60 IV.2.4. Tracheálna inervácia 61 IV.2.5. Morfológia priedušnice 63 IV.2.5.1. Chrupavka 63 IV.2.5.2. Epitel 63 V. Zhrnutie 65 VI. Zhrnutie 67 VII. Referencie 69 VIII. Prehľad materiálu 82 VIII.1 Pufre a roztoky 82 IX. CV 85 X. Poďakovanie 86 XI. Vyhlásenie 87 XII. Vlastné publikácie 88 V
1. Zoznam skratiek: Obrázok Obrázok ABCA3 ATP väzobná kazeta Bunky AE1 Alveolárne epiteliálne bunky typu I Bunky AE2 Alveolárne epiteliálne bunky typu 2 AK Typ protilátky Arteria BAL Bronchioalveolárny výplach BGW Spojivové tkanivo BMP Kosť Morfogénny proteín Chronický Pond Bronchius CGRP Kalcitonin-GGRP Laserová skenovacia mikroskopia DMEM Dulbeccovo modifikované Eaglove stredné FBS fetálne hovädzie sérum FEV nútený výdychový objem FGF fibroblastový rastový faktor FITC fluoresceín izotiokyanát HRP chrenová peroxidáza von Engl. Horsradishperoxidáza KG Kontrolná skupina KGF Keratinocytový rastový faktor LA Veľké agregáty LB Lamelové telieska z angl. Lamellar Bodies LLC Lewis Lung Carcinoma LM Light Microscopy KGF Keratinocyte Growth Factor Mito Mitochondria NANC Non-Adrenergic Non-Cholinergic Nucleus nzz Non-ciliated Cells PBS Fosfátový pufor soľný roztok PDGF Rastový faktor odvodený z doštičiek
PFA PPAR-γ Ref RF SA SD SMC SP SP-A SP-B SP-C SP-D SURS Tab TEM TF TG TGF-β TK TNF-α UA + O UD VEGF ad VIP ZP zz Paraformaldehyd Peroxizóm Proliferátor aktivovaný Receptor- γ referencia Richardsonovo farbenie Malé agregáty polotenké bunky hladkého svalstva z angl. Surfaktant hladkého svalstva Proteín Surfaktant Proteín A Surfaktant Proteín B Surfaktant Proteín C Systematický Jednotný Tabuľka náhodného vzorkovania Tabuľka prenosu Elektrónová mikroskopia Testovacie polia Skupina tumorov Transformujúci rastový faktor β Tumorkachexie Faktor endokultúry Faktor endokultúry Faktor endemátu Faktor V-faktora
2. Zoznam obrázkov: Obrázok I: Štruktúra pľúc na príklade myši 4 Obrázok II: Odber vzoriek pľúc pre mikroskopiu 14 Obrázok III: Telesná hmotnosť zvierat na začiatku (A) a na konci (B) experimentov 27 Obrázok IV: Porovnávacia mikroskopia svetla Reprezentácia pľúcneho parenchýmu s alveolmi a kapilárami 29 Obrázok V: Imunofluorescenčné mikroskopické znázornenie inervácie priedušnice 30 Obrázok VI: Imunofluorescenčné mikroskopické znázornenie priedušnice s 3D rekonštrukciou povrchu 32 Obrázok VII: Imunofluorescenčné mikroskopické znázornenie nervových vlákien priedušnice na celom preparáte mount 33 Obrázok VIII: Snímky tracheálneho epitelu skenovacím elektrónovým mikroskopom 34 Obrázok IX: Snímky steny trachey transmisným elektrónovým mikroskopom 35 Obrázok X: Prehľad stereologických údajov o systéme povrchovo aktívnych látok po 21 dňoch 38 Obrázok XI: Axónová dĺžka nervových vlákien obsiahnutých v priedušnici po 21 dňoch 39 Obrázok XII: Porovnanie stereologických systémov vzorkovania 47 Obrázok XIII: Schéma nameraných rastových faktorov a ich možných účinkov 57 VIII
3. Zoznam tabuliek: Tabuľka I: Použité protilátky (AK) 16 Tabuľka II: Protilátky (AK) na predbežnú prípravu 19 Tabuľka III: Počet zvierat na skupinu na skúmanú stereologickú hodnotu 20 Tabuľka IV: Prehľad stanovených objemových hustôt a objemov 22 Tabuľka V: Prehľad meracej metódy na stanovenie objemovej hustoty 22f. Tabuľka VI: Prehľad zistených povrchových hustôt a povrchov 24 Tabuľka VII: Prehľad metódy merania na stanovenie povrchovej hustoty 24 Tabuľka VIII: Objem pľúc a oblasť výmeny plynov (parenchým) 36 Tabuľka IX: Povrch alveol 36 Tabuľka X: Stereologické údaje alveolárnych epiteliálnych buniek typu II 37 Tabuľka XI: Stereologické údaje o inervácii priedušnice 39 Tabuľka XII: Stereologické údaje steny priedušnice 40 Tabuľka XIII: Objekty v priestore, ich zastúpenie v reze a stereologické testovacie systémy 49 Tabuľka XIV: Kvantitatívna PCR niektorých rastových faktorov vo vzorkách pľúc 56 Tabuľka XV: Krvná analýza v TG a KG 61 IX