Uvádza Michael Preukschas narodený v Brémach - PDF na stiahnutie zadarmo

Deoxyhypusínsyntáza ako možný cieľ pri liečbe multiformného glioblastómu a úloha dizertačnej práce in vivo pri eukaryotickom translačnom faktore eif-5a2 na získanie titulu doktor prírodných vied na Katedre biológie, Matematická fakulta, počítačová veda a prírodné vedy, Univerzita v Hamburgu predstavil Michael Preukschas narodený 27. septembra 1981 v Bremen Hamburg 2012

Opravená verzia Dátum sporu: 30. 8. 2013 1. recenzent: Prof. Dr. Joachim Hauber 2. recenzent: Prof. Dr. Julia Kehr ii

Veľká tragédia vedy - zabitie krásnej hypotézy škaredou skutočnosťou. “Thomas Henry Huxley Prezidentský prejav v Britskej asociácii pre rok 1870,„ Biogenesis and Abiogenesis “(Collected Essays, zv. 8) iii

Zoznam skratiek 6! Počas2toto2práca2vyrobené2publikácie2a! Posterové prezentácie2. 2100! 7! Literatúra2. 2102! 8.! Príloha 2. 2115! 8,1! Sekvencie primérov 2. 2115! 8,2! Lentirálne2 vektory2. 2116! 8,3! eifj5ajexpression2in2glioblastomen2 (rembrandtjdatabase) 2. 2117! 8,4! Čestné vyhlásenie2poistenie2. 2122! iv

Zoznam skratiek TMZ TPZ WHO Temozolomidové bunky propagujúce nádorové bunky Svetová zdravotnícka organizácia (Svetová zdravotnícka organizácia) iii

Zhrnutie stojí. Pomocou tejto knockoutovanej myši je možné získať nové poznatky o systémových a orgánovo špecifických funkciách u cicavcov. iii

Začatie bolo čiastočne vyjadrené na úrovni mrna, ale takmer nezistiteľné na úrovni proteínu 5,6,8. Oba proteíny sú kódované vlastným génom a každý z nich je prepísaný do piatich transkriptov. Niektoré z prepisov majú rôzne 3 -UTR alebo sú skrátené, čo má vplyv na rýchlosť translácie a tvorbu polysómov eif-5a2-mrna, najmä v prípade prepisov eif-5a2, a je pravdepodobne zapojený do regulácie expresie 8. Eif-5a2-mrna má tiež nižšiu stabilitu ako stabilita eif-5a. Aspoň časť rozdielnej expresie týchto dvoch izoforiem sa teda zdá byť vysvetliteľná týmito posttranskripčnými mechanizmami. Enzým DHS je zodpovedný za prvý krok syntézy hypusínu. Väčšina eukaryotov má jeden gén dhps konzervovaný v eukaryotoch a archeaách, ktorý kóduje DHS. Doteraz sa našli tri varianty transkriptu u ľudí, z ktorých však iba jeden kóduje aktívny proteín 9. Polyamín spermidín slúži ako substrát pre DHS. Prenos aminobutylového zvyšku zo spermidínu na eif-5a-lyzín 50 je proces závislý od NAD a je v zásade reverzibilný. DHS je a

Úvod do znižovania smrti buniek ostrovčekov pankreasu v súvislosti s apoptózou. Úloha eif-5a pri zápalových reakciách, ktoré sú rozhodujúce pre vznik cukrovky, sa odrazila aj v ďalších scenároch. Perorálne podávateľná forma CNI-1493 nazývaná CPSI-2364 bola testovaná na liečbu Crohnovej choroby, autoimunitného chronického zápalového ochorenia čreva. Aj tu sa preukázal protizápalový účinok, ktorý súvisel s inhibíciou DHS. Hypotézu, že proteíny eif-5a a enzýmy tvoriace hypusín sú zapojené do patogenézy mnohých malígnych novotvarov, podporuje stúpajúci počet štúdií. Hodnotenie účasti týchto proteínov na iných druhoch rakoviny bolo preto zrejmou voľbou. Tu boli obzvlášť zaujímavé malígne novotvary, pre ktoré je doposiaľ k dispozícii iba niekoľko účinných terapeutických možností. Patria sem najmä nádory mozgu vyššej triedy, ktorých liečba je zriedka úspešná, bez ohľadu na to, či je chirurgická, klasickou rádioterapiou/chemoterapiou alebo cielenou molekulárnou terapiou. Preto boli eif-5a1/2, DHS a DOHH skúmané ako možné terapeutické ciele u astrocytómov vyššieho stupňa. 9

Zavedenie špecifických onkogénov u každého pacienta bude nevyhnutné vzhľadom na heterogenitu medzi nádormi. Pretože v rámci GBM nádoru 120 existuje veľká heterogenita a možno aj klonálny vývoj a pri biopsii 121 sa často nedajú zistiť všetky mutácie, nové, nákladovo efektívne technológie (napr. Sekvenovanie exome) a zacielenie sa budú pravdepodobne líšiť, zbytočné ciele pomáhajú prekonať tieto ťažkosti. 18

Materiál a metódy 19 2 Materiál a metódy 2.1 Materiál 2.1.1 Chemikálie a médiá pre baktérie Tabuľka 2: Chemikálie a činidlá použité v tejto práci. Chemická látka/činidlo/médium/roztok Aceglow ECL, roztok akrylamid-bis, 30% adriamycín (doxorubicín), agaróza, ampicilín, BCNU, Bradfordovo činidlo, BSA, brómfenolová modrá, CHAPS, chloroform, chlorochin, difosfát, DEPC, voda, DMEM + Glutamax, DMSO, kyselina octová, kyselina octová (kyselina octová) Teľacie sérum (FCS) Glutaraldehyd (50%) Glycín Glycerín Hemalum podľa Mayera Isopropanol Draslík octan Výrobca Peqlab Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Bio-Rad Roth Roth Roth Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Invitrogen Invitrogen Sigma-Aldrich 19. Roth Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Roth Roth Roth Roth Roth Roth

Materiál a metódy 20 Chlorid draselný LB agar LB médium Odstredené mlieko v prášku β-merkaptoetanol Metanol (MeOH) M-MuLV octan sodný chlorid sodný hydroxid sodný hydroxid sodný orthovanadát neesenciálne aminokyseliny Oligo d (t) primér paraformaldehyd PBS penicilín/streptomycín riblockol riblockáza Rotiszint eco plus kyselina chlorovodíková (HCl) SDS SOC-médium Spermín Spermidín SYBR Zelená PCR Master Mix TEMED Temozolomid Trícium spermidín Tris báza Tris-HCl TriFast Roth Roth Roth Roth Sigma-Aldrich JT Baker Fermentas Roth Roth J.T. Baker Sigma-Aldrich Gibco Invitrogen Sigma-Aldrich Lonza Gibco GE Healthcare Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Fermentas Roth Roth Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Roth Roth Finnzymes Roth Sigma-Aldrich Perkin-Elmer Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Peqlab 20

Materiály a metódy 21 Trypánová modrá TritonX-100 0,5% trypsín + EDTA Tween20 Močovinový biochróm Sigma-Aldrich Gibco Roth Sigma-Aldrich 21

Materiály a metódy 22 2.1.2 Vybavenie a materiály Materiály a vybavenie, ktoré nie sú uvedené, sú štandardným laboratórnym vybavením. Tabuľka 3: Vybavenie a materiály použité pri tejto práci. Vybavenie/materiál Kryovírusová kultúra Sklíčka, 4 komory Prietokový cytometer FACS Kalibrové elektroforetické komory FUSION SL Advance Gel dokumentácia Kabinet Eagle Eye II GenePulser XCell Homogenizer Omni TH Immobilon PVDF membrána Mastercycler Gradient Čítačka mikrodoštičiek Wallac Victor mikroskop Bunková kultúra Axiovert 40 milipetor Mr., ND 1000 napájací zdroj PowerPac NuPage polyakrilamidové gély ProteanXL veľkosť ExtraThick Blot papier Realtime PCR-Cycler Mx3000P röntgenové filmy röntgenová kazeta TransBlot SemiDry-Blotter Tri-Carb 2900TR Vi-cell XR kultivačné banky, rôzne veľkosti misky na bunkové kultúry a misky Centrifuge 5810R-Centrifuge 5415C Biosciences BD Biosciences Biorad/Invitrogen Peqlab Stratagene Biorad Omni International Milipore Eppendorf Perkin-Elmer Zeiss Millipore Roth Nalgene Peqlab Eppendorf Biorad Invitrogen Biorad Stratagene Thermo-Scientific Rego Biorad Perkin-Elmer Beckman-Coulter Sarste dt Sarstedt Eppendorf Eppendorf Sarstedt 22

Materiály a metódy 23 2.1.3 Pufre a roztoky Pokiaľ nie je uvedené inak, na prípravu sa použila Millipore filtrovaná voda. Roztoky sa skladovali pri izbovej teplote (RT). “Tabuľka 4: Použité pufre a roztoky Roztok Bakteriálna práca Resuspenzný roztok Zloženie 50 mm Glukóza 25 mm Tris, pH 8,0 10 mm EDTA, pH 8,0 Skladovanie pri 4 ° C alkalický lýzovací tlmivý roztok 0,2 N NaOH 0,5% SDS zrážací tlmivý roztok 25% 5M KAc 15% HCl TE tlmivý roztok molekulárna biológia 50x biochémia proteínu TAE 100% kyselina trichlóroctová (TCA) ) 0,1 mm EDTA 10 mm Tris (pH 7,5) 242 g Tris báza 57,1 ml acetátu 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) H20 a 1000 ml 40 g TCA 20 ml H 2 O 0,5 M Tris, pH 6,8 50 mm DTT 6 g Tris báza 60 ml H 2 O pH 6,8 H 2 O a 100 ml 23

Materiály a metódy 24 1,5 M Tris 27,23 g Tris báza 80 ml H 2 O pH 8,8 H 2 O a 100 ml 5 x SDS prevádzkový tlmivý roztok 360 g glycínu 75 g Tris báza H 2 O a 1 000 ml ekvilibračného tlmivého roztoku 1 0,375 M Tris-HCl (ph 8,8) 6 M močovina 20% glycerol (v/v) 2% SDS (w/v) 130 mm DTT ekvilibračný tlmivý roztok 2 0,375 M Tris-HCl (ph 8,8) 6 M močovina 20% glycerol (v/v) 2% SDS (w/v) 135 mm jodoacetamid PBST 2 000 ml PBS 1 ml Tween20 močovinový pufor 8 M močovina 2 M tiomočovina 2% CHAPS 50 mm DTT polosuchý blotovací tlmivý roztok 25 g SDS 5,82 g Tris báza 2,93 g glycínu 1,90 ml 20% SDS 200 ml metanolu H20 a 1000 ml skladovanie pri 4 ° C

Materiál a metódy 25 Cell Lysis Buffer (RIPA) 150 ul 1 M NaCl 50 ul 1 M Tris-HCl (ph 7,6) 50 ul 20% Nonident P40 (v/v) 25 ul 10% Na deoxycholate (v/v) 10 ul inhibítora proteázy a 1 000 ul H20 bunkového cyklu, apoptóza a starnutie DNA extrakčný pufor 192 ml 0,2 M Na2 HPO 4 8 ml 0,1% Triton X-100 (v/v) pH 7,8 roztok propidium jodidu 200 μg propidium jodidu 1 mg RNázy 10 ml PBS fixačného roztoku 0,25% glutaraldehydu (250 ul) 2% paraformaldehydu (1 g) PBS (pH 5,5; 50 ml) 20x kyanid draselný (KC) 820 mg K 3 F (CN) 6 1050 mg K 4 FE (CN) 6 x 3H20 25 ml PBS 40x X-GAL 40 mg 5-bróm-4-chlór-3-indolylp-d-galaktozid 1 ml N, N-dimetylformamid 2.1.4 Oligonukleotidy Použité oligonukleotidy boli Navrhnuté pomocou softvéru Primer3 122, ak je to možné. Vlastnosti primérov pre homológne rekombinácie (najmä tendencia k tvorbe diméru) sa stanovili pomocou softvéru Oligoanalyzer 1.2 (Freeware, T. Kuulasmaa, Univerzita v Turku, Fínsko). 25

Materiál a metódy 26 2.1.5 Protilátky Tabuľka 5: Primárne a sekundárne protilátky použité pre imunobloty a FACS aplikácie. Uvádza sa cieľový proteín, hostiteľ pôvodu, použité zriedenie a výrobca. Protilátka Host Riedenie Výrobca Anti-Mouse HRP Ovce 1: 10 000 GE Healthcare Anti-králik HRP koza 1: 10 000 Cell Signaling Technologies Anti-eIF-5A králik 1: 5 000 Novus Anti-DHS králik 1: 1000 Santa Cruz Anti-DOHH králik 1: 1000 Eurogentec Anti-p53 králik 1: 1000 Santa Cruz Anti-p21 Waf1/Cip1 králik 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-AKT králik 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-pAKT králik 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-Rb králik 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-pRB Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-β-Tubulin Mouse 1: 10 000 Oncogene Anti-active-Caspase3- Rabbit 1: 5 BD Pharmingen PE IgG 1 -PE Isotype Mouse 1: 5 BD Pharmingen Kontrola 2.1.6 Médium pre bunkovú kultúru Tabuľka 6: Médiá pre kultiváciu buniek použité v tejto práci a ich zloženie. Roztok Gliommedium Zloženie Dulbeccos modifikované Eagle médium 4500 mg/l glukóza L-glutamín 1 mm pyruvát sodný 1: 100 penicilín/streptomycín 10% FCS astrocytové médium DMEM/F-12 4500 mg/l glukóza 1 mm L-glutamín 26

Materiály a metódy 27 1 mm pyruvát sodný 1: 100 penicilín/streptomycín 20% FCS DMEM rastové médium Dulbeccovo modifikované Eagle médium 4500 mg/l glukóza 1 mm L-glutamín 1: 100 penicilín/streptomycín 10% FCS (20% FCS pre NHA) zmrazovacie médium FCS 10% DMSO DMEM-ES médium Dulbeccovo modifikované Eagle médium (25 mm HEPES) 15% FCS 2 mm L-glutamín 0,1 mM MEM 0,05 mg/ml zmes penicilín/streptomycín nukleozid (adenozín 1,3 μg/ml; guanozín 1, 37 μg/ml; cytidín 1,18 μg/ml; uridín 1,18 μg/ml; tymidín 0,38 μg/ml) 1 mm pyruvát sodný 100 μm 2-merkaptoetanol 1 000 U/ml voliteľná selekčná prísada ESGRO-LIF: 150 250 μg/ml G418 Médium KSOM/HEPES, pH 7,4 95 mm NaCl 2,5 mm KCl 350 µm KH4PO4 200 µm MgSO4 médium pre MEF (výživné bunky) DMEM 9% FBS 0,1 mm NEAA 50 U penicilín/50 µg/ml streptomycín Médium embryonálnych kmeňových buniek 27

Materiály a metódy 28 DMEM 25 mm HEPES 15% FBS 2 mm L-glutamín 0,1 mm NEAA 50 U penicilín/50 ug/ml streptomycínová nukleozidová zmes (1,3 ug/ml adenozínu; 1,37 ug/ml guanozínu; 1, 18 μg/ml cytidínu; 1,18 μg/ml uridínu; 0,38 μg/ml tymidínu) 1 mm pyruvát sodný 100 μm β-merkaptoetanol 1 000 U/ml ESGRO-LIF 28

Materiál a metódy 29 2.1.7 Použité bunky Bunkové línie a primárne bunky použité v tejto práci sú uvedené v tabuľke 7. Primárne myšie embryonálne fibroblasty (MEF) sa tiež použili ako podporné bunky na kultiváciu ES buniek. Tabuľka 7: Bunkové línie použité v tejto práci, ako aj ich živné médiá a pôvod. Stredný zdroj bunkovej línie Phoenix Eco® - (Modifikovaná HEK293T, stabilne transfekovaná dvoma plazmidmi, ktoré kódujú sekvencie vírusu MML pre „gag“, „pol“ a „env“.) DMEM Stanford University (USA) U87-MG (adherentná bunková línia ľudského astrocytómu.), izolované z WHO stupňa IV astrocytómu. Relevantné mutácie: Deletovaný lokus Ink4Arf) Gliómové médium ATCC (číslo: HTB- 14) G55T2 (adherentná bunková línia ľudského astrocytómu, izolované z astrocytómu stupňa WHO IV. bodová mutácia v doméne viažucej DNA) Gliommedium Neurosurgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf; Westphal 1994 NHA (normálne ľudské astrocyty, primárne, diferencované astrocyty z ľudského mozgového tkaniva) médium astrocytov Invitrogen (Darmstadt; N7805-100) bunky C57BL/6N JM8.F6 (myšie embryonálne kmeňové bunky) médium DMEM-ES W. Skarnes, Wellcome Trust Sanger Institute, Kalifornia, USA 29

Materiál a metódy Na elektroforetickú separáciu proteínov sa použilo 36 SDS-Page 12% polyakrylamidových gélov. Sklenené platne sa umiestnili do lejacieho stojana a separačný gél (10 ml) sa zmiešal z nasledujúcich roztokov: 3,35 ml H20 4 ml 30% akrylamidu 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 50 ul 20% SDS 50 μl 10% APS 10 μl TEMED Zmes sa naliala medzi sklenené platne a zakryla sa 1 ml izopropanolu, kým po 20 minútach polymerizovala. Zberný gél (4%, 5 ml) bol medzitým pripravený: 3,05 ml H20 0,66 ml 30% akrylamidu 1,25 ml 0,5M Tris-HCl (pH 6,8) 25 ul 20% SDS 5 ul TEMOVANÝ Po odstránení izopropanolu a opláchnutí separačného gélu vodou sa zberný gél nalial na separačný gél a vložil sa vreckový hrebeň (10 vreciek s hrúbkou 1,5 mm). Po 20 hodinách sa gél umiestnil do prevádzkovej komory a tento sa naplnil prevádzkovým pufrom. Príprava vzorky 5x nanášací pufor a 20x denaturačné činidlo (obidva od spoločnosti Fermentas, St. Leon-Roth) sa zmiešali s požadovaným objemom proteínového lyzátu a doplnili sa na požadovaný objem (10 50 ul) pufrom RIPA. Zmes sa varila 5 minút pri 95 ° C, aby sa denaturovali proteíny, a potom sa uložila na ľade. 36

Výsledky 73 AB telesná hmotnosť [g] 30 28 26 24 22 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 20 1 3 5 8 10 12 15 17 C 1,0 deň hmotnosť nádoru [g] 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 Obr. 20 Testovacia sekvencia experimentov s xenoimplantátmi in vivo a účinok GC7 v xenoštepovom modeli G55T2 in vivo na hmotnosť zvierat a hmotnosť nádoru. (A) Testovacia sekvencia experimentov xenoimplantátov in vivo s bunkami G55T2. Bunky G55T2 boli injikované subkutánne dorzálne do myší NSG. Po úspešnom raste a vzniku nádoru sa GC7 podával i.p. každý deň. podané. Po siedmich dňoch liečby sa nádory pripravili, zvážili, zmerali a uchovali na extrakciu proteínom/imunohistochemické farbenie. Stav hypusínu (a teda účinok GC7) sa stanovil pomocou 2D Western blotu (B) Priebeh telesnej hmotnosti myší NSG po subkutánnej injekcii buniek G55T2 a dennej liečbe 0,1 mg, 0,15 mg, 0, 2 mg GC7 alebo PBS ako kontrola rozpúšťadla (priemer ± SEM). (C) hmotnosť nádoru po 7 dňoch liečby GC7. (Hmotnosť jednotlivých nádorov a priemer/kohorta ± SEM). Ošetrenie viditeľné (napr. Huňatá kožušina, odreté miesta). BehaV 73 tiež

Výsledky 75 3.3 Vytvorenie knockoutovanej myši eif5a2 3.3.1 Vytvorenie cieľového konštruktu eif5a2 Na základe informácií o sekvencii génu eif5a2 (názov myšieho homológu s ľudským génom eif-5a) bola vybraná klonovacia stratégia a oblasť sekvencie, ktorá sa má deletovať. Táto oblasť zahrnuje exóny 1 3 a uzatvára Obr. 22 Schematické znázornenie subklonovania homológnou rekombináciou. Lineárny minimálny vektor (čierny) s homológnymi oblasťami (modrá) k BAC sa elektroporuje do klonu E. coli, ktorý nesie BAC s modifikovaným segmentom DNA (sivý). teda štart translácie a lyzín 50 v exóne 2, ktorý nesie kritickú modifikáciu hypusínu. Ako je opísané v časti 1.2.7, BAC RP23-361F2 slúži ako východiskový bod pre klonovanie vektorového konštruktu. Použila sa tu metóda rekombinácie (klonovanie pomocou homológnej rekombinácie) (uvedená ako príklad na obr. 22). Integrita génu eif5a2 v BAC sa najskôr potvrdila sekvenovaním. Minimálny vektor pstartk sa potom amplifikoval pomocou PCR a pomocou primérov sa pridali ramená homológie umiestnené 5 a 3 génu eif5a2. Produkt PCR sa analyzoval elektroforézou na agarózovom géli 75

Publikácie a posterové prezentácie vytvorené počas tejto práce 101 Komplexná sieťová interakcia proteínov s modifikáciou hypusínu súvisiacou s rakovinou. Sievert H, Venz S, Platas Barradas O, Schaletzky M, Preukschas M, Bokemeyer C, Pörtner R, Walther R, Balabanov S (2011): EMBO Conference Cancer Proteomics 2011 Plagátová prezentácia Sekrečný fenotyp spojený s telomérami (TASP) spolupracuje s BCR- ABL riadi malígnu proliferáciu myších krvotvorných kmeňových buniek Melanie Braig, Nora Pällmann, Michael Preukschas, Doris Steinemann, Anne Gompf, Karl L. Rudolph, Andreas Schuppert, Stefan Balabanov a Tim H. Brümmendorf Príprava prezentácie plagátu 101

Príloha 115 8 Príloha 2 8.1 Sekvencie primérov Konštrukcia vyradenia ef5a2: Vymenujte sekvenčný primér eif5a2 v pstartk pstartrev-seq1-r pstart-k Seq fwd Primer na pridanie homologických ramien k eif5a2 alebo k rezistenčným kazetám A2 primer1 A2 primer2 eif5a2 -pre eif5a2-kanneo-loxp-rev eif5a2-kanneo-frt-f eif5a2-kanneo-frt-r sonda primer 3'-sonda3-f 3'-sonda3-f ďalšie sekvenčné priméry pws-tk6-ori-f A2-TK6-Ori -r A2-A2 TK6-3'-F-r-TK6-3 'sekvencie (5'-3,) tgacagcagacgtgcactgg CTC GGG CCC CAA ATA ATG AT gagcccctcctgtacagcctgggtgttggtgaagggggaatccaagagttacgc GTcgactgaattggttcctttaaagc gagacagacgagttaaggagatacaagaggaaagaaggaagatggaggaa gccgcactcgagatatctagaccca aactgaagatgaggatgcatctcgcccgggaacactgcgaagcttcaaacaattaa ccctcactaaagggcg gtgctgcggattagtgcacttccggcgtgcagagctgcctgcagtcgacttaatacga ctcactatagggctc CTAGGGCCGGCCATTAATaattaaccctcactaaag CTAGTTAATTAAAAGCTTGTTAACtaatacgactcactatag cacacattacatgaattataagg ctgtcccagctcttaactgc gtgagcgaggaagcggaatatatc catccgtcagtctagtaatttcc gggaaatg tggattgctgtc tataaacccgcagtagcgtg 115

---