Vplyv indukovateľnej hemoxygenázy (HO-1) na mikrocirkuláciu v

Z Kliniky chirurgickej univerzity Kliniky všeobecnej a vnútornej chirurgie na Univerzite Alberta Ludwiga vo Freiburgu i.br. Vplyv indukovateľnej hemoxygenázy (HO-1) na mikrocirkuláciu pri postischemickej pankreatitíde I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N na získanie titulu lekár z Lekárskej fakulty Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. V roku 2006 predstavil Moritz Scholtes narodený v Aachene

indukovateľnej

2 Dekan: Prof. Dr. med. C. Peters 1. recenzent: PD Dr. med. O. Thomusch 2. recenzent: Prof. Dr. med. B. Členenie Rok promócie: 2007

4 Na túto prácu dozeral Dr. med. E. von Dobschütz

5 OBSAH 1. ÚVOD. 7 1.1 AKÚTNA PANKREATITÍDA. 7 1.2 MIKROOKRUH. 8 1.3 REPERFÚZIA ISCHÉMIE. 9 1.4 HEMDEGRADÁCIA Z HEMOXYGENÁZY. 11 1.4.1 Reakcia hemoxygenázy a jej produktov. 12 1.4.1.1 Železo. 13 1.4.1.2 CO. 1.4.1.3 Biliverdín a bilirubín. 13 1.4.2 Ho izoenzýmy HO: štruktúra, distribúcia, regulácia. 14 2. CIEĽ ŠTÚDIE. 17 3. MATERIÁL A METÓDY. 18 3.1 PREDBEŽNÁ POZNÁMKA. 18 3.2 EXPERIMENTÁLNY MODEL. 18 3.2.1 Pokusné zvieratá. 18 3.2.2 Predbežná liečba a lieky. 18 3.2.3 Anestézia a ventilácia. 19 3.2.4 Mikrochirurgická technológia. 20 3.3 SPÔSOBY SKÚŠKY. 23 3.3.1 Makrohemodynamika. 23 3.3.2 Mikrohemodynamika. 23 3.3.2.1 Funkčná kapilárna hustota. 24 3.3.2.2 Interakcia leukocytov a endotelu. 25 3.3.3 Laboratórne parametre. 3.3.4 Stanovenie HO-1. 26 3.3.4.1 Doklad o činnosti. 27 3.3.4.2 Analýza Northern blot. 29 3.3.4.3 Analýza Western blotom. 31 3.4 EXPERIMENTÁLNY PROTOKOL. 32 3.4.1 Skúšobné skupiny. 32 3.4.2 Skúšobný postup. 32 3.4.2.1 Podmienky kontroly. 32 3.4.2.2 Ischemicko-reperfúzna pankreatitída. 33 3.4.2.3 Indukcia hemovej oxygenázy 1. 34 3.4.2.4 Inhibícia aktivity hemoxygenázy. 35 3.5 ŠTATISTIKA. 35

6 4. VÝSLEDKY. 36 4.1 MAKROHAEMODYNAMIKA. 36 4.2 MIKROHAEMODYNAMIKA. 38 4.2.1 Funkčná kapilárna hustota. 38 4.2.2 Interakcia leukocytov a endotelu. 41 4.3 LABORATÓRNE PARAMETRE. 44 4.4 DETEKCIA HEMOXYGENÁZY. 45 4.4.1 Doklad o činnosti. 45 4.4.2 Northern blot. 46 4.4.3 Western blot. 47 4.5 PREHĽAD. 47 5. DISKUSIA. 48 5.1 DISKUSIA O METODIKE. 48 5.1.1 Experimentálna akútna pankreatitída. 48 5.1.2 Merané parametre. 51 5.1.2.1 Kvantifikácia mikrohemodynamiky. 51 5.1.2.2 Kvantifikácia interakcie leukocytov a endotelu. 53 5.1.2.3 Doklad o činnosti. 55 5.1.2.4 Northern blot. 56 5.1.2.5 Western blot. 57 5.2 DISKUSIA O VÝSLEDKOCH. 5.2.1 Vplyv ischémie a reperfúzie. 58 5.2.1.1 Makrodemodynamika. 58 5.2.1.2 Mikrohemodynamika. 58 5.2.1.3 Interakcia leukocytov a endotelu. 62 5.2.1.4 Expresia a aktivita hemoxygenázy. 63 5.2.2 Vplyv HO-1. 65 5.2.2.1 Makrodemodynamika. 66 5.2.2.2 Mikrohemodynamika. 66 5.2.2.3 Interakcia leukocytov a endotelu. 69 5.2.2.4 Expresia a aktivita hemoxygenázy. 71 6. ZHRNUTIE. 72 7. ZOZNAM LITERATÚRY. 73 8. ZOZNAM OBRÁZKOV A TABUĽIEK. 92 9. ZOZNAM SKRATIEK. 95 10. POĎAKOVANIE. 96 11. ŽIVOTOPIS. 98

10 Tieto mechanizmy vedú k poruche mikrocirkulácie, ktorá vedie k zníženému prívodu energie do tkaniva a udržuje tak začarovaný kruh (obrázok 1). Na + -K + - ATPáza Na + -Ca 2+ - antiport ATP Na + Ca 2+ Proteázy XDh O 2 Hyx + XOx Ischémia Krv-O 2 Reperfúzia O 2 -radikálna permeabilita Edém Trombóza Zrážanie leukocytov Degradácia ECM Porucha mikrocirkulácie Aktivácia leukocytov Poškodenie buniek Poškodenie endotelu Enzýmy Cytokíny Obrázok 1: Začarovaný kruh ischemicko-reperfúzneho poškodenia: Procesy pri ischémii (hore) spôsobujú poškodenie buniek pri reperfúzii (dole), čo vedie k ďalšiemu hypoxickému poškodeniu tkaniva

17 2. CIEĽ ŠTÚDIE Cieľom tejto experimentálnej štúdie bolo preskúmať účinky hodinovej ischémie a dvojhodinovej reperfúzie na mikrocirkuláciu pankreasu. Skúmalo sa, či a ako sa podmienky v čase menia. Ďalej by sa malo určiť, či a akým spôsobom ovplyvňuje tieto podmienky exogénna indukcia indukovateľnej hemoxygenázy (HO-1). Skúmala sa najmä funkčná hustota kapilár ako parameter stavu zásobovania výživou pri reperfúzii a interakcia leukocytov a endotelu ako parameter skorej zápalovej reakcie. Na stanovenie týchto parametrov bola použitá metóda intravitálnej epifluorescenčnej mikroskopie. Vplyv hemoxygenázy na jej expresiu a aktivitu bol overený molekulárnou biológiou. Podľa výskumnej otázky je práca rozdelená do nasledujúcich častí: 1. Účinky ischémie a reperfúzie na mikrocirkuláciu pankreasu bez exogénneho vplyvu na hemoxygenázu 2. Účinky indukcie hememoxygenázy na mikrocirkuláciu pankreasu pri postischemickej pankreatitíde

Obrázok 5: Schematický priebeh ciev v pankreatických artériách (od HOFFMANN 70)