Vplyv metotrexátu na metabolizmus homocysteínu Štúdie leukémie a

1 Vplyv metotrexátu na metabolizmus homocysteínu: štúdie na pacientoch s leukémiou a lymfómom Dizertačná práca na získanie doktorského titulu (Dr. rer.nat.) Matematickej a prírodovedeckej fakulty Rheinische-Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, ktorú predložil ACHIM BECKER z ​​Trevíru Bonn 2004

vplyv

2 Pripravené so súhlasom Fakulty matematiky a prírodných vied Rheinische-Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn. Táto dizertačná práca je zverejnená elektronicky na univerzitnom publikačnom serveri ULB Bonn. 1. Rečník: Prof. Dr. U. Jaehde 2. rečník: Prof. Dr. Deň promócie G. Bendu:

4 Zvlášť by som sa chcel poďakovať svojej priateľke Jutte Schneiderovej za trpezlivosť a ochotu pomôcť, najmä v záverečnej fáze práce. Na záver by som sa chcel poďakovať svojej matke a mojim súrodencom, ktorí ma vždy podporovali a vždy mi poskytovali spoľahlivú podporu aj v zložitých časoch.

5 Moja rodinná pochybnosť nie je pohodlná, ale istota je absurdná. Voltaire

6 Obsah 1 Úvod Homocysteín Metabolizmus homocysteínu Príčiny hyperhomocysteinémie Klinické príznaky hyperhomocysteinémie a terapeutické odporúčania Patomechanizmy Metotrexát Chemická štruktúra Farmakokinetika Mechanizmus účinku Klinické aplikácie Neurotoxicita MTX Problém a cieľ Materiál a metódy Materiály Chemikálie a činidlá Použité roztoky a pufre Spotrebný materiál Prístroje Analýza CE. 35

7 Obsah Základy kapilárnej elektroforézy Vývoj separačného systému na stanovenie excitačných aminokyselín obsahujúcich síru (SEAA) Vývoj metódy Optimalizácia metódy na stanovenie SEAA v lúhu Validácia metódy CE Meranie vzoriek lúhu HPLC analýza HPLC systém a chromatografické podmienky Redukcia a predkolónová derivatizácia aminotiolov Vývoj metódy a -optimalizačná metóda validácia meranie vzoriek CSF fluorescenčná polarizačná imunoanalýza princíp merania fluorescenčnej polarizačnej imunotesty vykonávanie špecifikácií merania systému IMx validácia metódy FPIA výrobcom čiastočná validácia metódy FPIA na stanovenie homocysteínu v plazme klinické vyšetrenia pediatrickí pacienti s akútnou lymfocytovou leukémiou. 68

8 Obsah Dospelí pacienti s primárnym lymfómom centrálneho nervového systému Zdraví dospelí (kontrolná skupina) Prípadová štúdia u pacienta s predávkovaním MTX Farmakokinetické výpočty Klírens AUC Štatistická analýza údajov Popisná štatistika Štatistické testy na testovanie diferenciálnych hypotéz Korelačná analýza Regresná analýza Výsledky CE metóda na stanovenie excitačných aminokyselín obsahujúcich síru v Separácia CSF excitačných aminokyselín obsahujúcich síru Optimalizácia derivatizácie Porovnanie citlivosti detekcie UV a LIF Optimalizácia metódy pre analýzu CSF Metóda validácie HPLC na stanovenie cysteínu, homocysteínu a glutatiónu v CSF. 111

9 Obsah Vývoj/optimalizácia metódy Validácia metódy HPLC Výsledky čiastočnej validácie FPIA Vplyv vysokých dávok MTX na metabolizmus homocysteínu Vyšetrenia u pediatrických pacientov s akútnou lymfoblastickou leukémiou (Štúdia Total XV) Vyšetrenia u pacientov s PZNSL Prípadová štúdia u pacienta s predávkovaním MTX Diskusia CE metóda na stanovenie excitačných aminokyselín obsahujúcich síru v CSF Metóda HPLC na stanovenie homocysteínu, cysteínu a glutatiónu v CSF Vplyv vysokodávkovej MTX chemoterapie na metabolizmus homocysteínu Štúdie u pediatrických pacientov s ALL Štúdie u pacientov s PZNSL Prípadová štúdia a Pacient s predávkovaním MTX homocysteínom, biomarkerom neurotoxicity vyvolanej MTX? Príloha súhrnnej literatúry. 222

10 Zoznam skratiek ABDF AG AICAR AICAR-TF AK AL ALL ASP ATP BHMT C1 (8), (15) C1h23 (42) C15h23 (42) CA CBQCA CBS CGL CFSE cp ss CNS CSA CV CYS DAMPA DHB DHF DHFR DHP DHPR 4- ( Aminosulfonyl) -7-fluórbenzofurazánový antigén aminoimidazolkarboxamid-ribonukleotid aminoimidazolkarboxamid-ribonukleotid transformyláza pracovný roztok protilátky akútna lymfatická leukémia kyselina L-asparágová (aspartát) adenozíntrifosfátbetaín homocysteín 1. deň alebo 8. alebo 15. deň alebo metylát konsolidácie 1. deň konsolidácie, 23 (42) hodín po začiatku infúzie vysokých dávok MTX 15. deň konsolidácie, 23 (42) hodín po začiatku infúzie vysokých dávok MTX, kyselina cysteínsulfónová, 4- (2-formyl-3-chinolínkarbonyl) -benzoová kyselina cystationín-ß-syntáza cystationín-y-lyáza 5-karboxyfluoresceín sukcínimidylester ustálený stav koncentrácia v plazme centrálny nervový systém (centrálny nervový systém) variačný koeficient kyseliny cysteínsulfínovej (variačný koeficient) cysteín 2,4-diamino-N 10-metyl-p kyselina teroová dihydrobiopterín dihydrofolová kyselina (dihydrofolát) dihydrofolát reduktáza dihydropteridín dihydropteridín reduktáza

11 DMF DTT E ECD EDTA EOF FD FDA FGAR FICAR FITC FPGS FPGH FPIA FQCA FR GAR GAR-TF GLU GSH GTP HCY HCSA HCA HDMTX HR ICV ICVMTX IM IMP IT ITMTX IV N, N-dimetylformamid elektrická detekcia, elektrická detekcia, elektrická difúzia, elektrická detekcia, elektrická difúzia, elektrická difúzia, elektrická difúzia, elektrická difúzia, elektrická difúzia Úrad pre potraviny a liečivá Formylglycínamidribonukleotid 5-formamidoimidazol-4-karboxamidribonukleotid fluoresceín folát-kyselina listová Polyglutamatsyntetáza Polyglutamathydroláza fluorescenčná polarizácia Kyselina homocysteínsulfónová Liečba vysokými dávkami metotrexátu (podáva sa intravenózne) Vysoko rizikové intracerebroventrikulárne intracerebroventrikulárne podávané metotrexát Intramuskulárne inozínmonofosfát intratekálne intratekálne podávaný metotrexát intravenózne

12 K KPF LDL LIF (D) LLOQ LOD LR MAT ME MP MEKC MeOH mfbp MS MTHFR MTX MTX Kontrolná skupina Opravená plocha píku Lipoproteíny s nízkou hustotou Laserom indukovaná fluorescencia (detekcia) Dolná hranica kvantifikácie (dolná hranica kvantifikácie) Limita detekcie (detekčná hranica) Nízka -Risk metionín adenozyltransferáza merkaptoetanol merkaptopropanol Micelárna elektrokinetická chromatografia metanol spojený s membránou viažuci folát proteín metionín syntáza N 5, N 10 -Metylén tetrahydrofolát reduktáza metotrexát metotrexát polyglutamát (e) µ elektroforetická mobilita μO Foretická mobilita µOF N 5-FTHF N 10-FTHF NHL N 5, N 10-MTHF N 5-MTHF NMDA PRPP PO PZNSL QC-sonda r N-acetylcysteín N 5-formyl tetrahydrofolát N 10-formyl tetrahydrofolát Non-Hodgkinov lymfóm N 5, N 10 - Metylén tetrahydrofolát N 5-metyl tetrahydrofolát N-metyl-D-aspartát α-5-fosforibozyl-1-pyrofosfát per os (orálne) Primárny lymfóm centrálneho Ne korelačný koeficient vzorky kontroly kvality rvensystems

13 RE RFC RI ROS RSD S SD SAH SAHH SAM SBDF SDS SEAA SHR SL SR ss t ½ TBP THB THF TIT ULOQ v VK Relatívna chyba (relatívna chyba) Znížená remisia/indukcia nosiča folátu Reaktívne formy kyslíka Relatívna štandardná odchýlka (variačný koeficient) Štandardná štandardná odchýlka (Štandardná odchýlka) S-adenozylhomocysteín S-adenozylhomocysteínhydroláza S-adenozylmetionín 4- (sulfo) -7-fluórbenzofurazan dodecylsulfát sodný Excitačné aminokyseliny obsahujúce síru (excitačné stabilné aminokyseliny obsahujúce síru) štandardný/vysoko rizikový zásobný roztok štandardné štátne riziko Polčas rozpadu Tributylfosfín Tetrahydrobiopterín Kyselina tetrahydrofolová (tetrahydrofolát) Intratekálna trojitá terapia Horná hranica kvantifikácie (horná hranica kvantifikácie) Migračná rýchlosť Variačný koeficient x stredná hodnota x

Medián Z Transformovaný korelačný koeficient CNS Centrálny nervový systém

19 Page 6 Úvod Nedostatok čerstvého ovocia a zeleniny, nedostatok folátov je najbežnejším nedostatkom vitamínov v Európe. Priemerný denný príjem folátov s jedlom (

25 Page 12 Úvod Neurotoxické reakcie sprostredkované homocysteínom je možné významne znížiť podávaním antagonistov receptora NMDA 67,71,72. Cl - kanál Ca 2+ kanálový kainát NMDA AMPA mglu Na + Na + Na + PLC Cl - Ca 2+ IP 3/DAG proteázy (Kalpaine I/II), fosfolipázy (PLA 2, PLC), endonukleázy, proteínkinázy (CaMPK II, PKC), peroxidácia lipidov NO syntázou, poškodenie cytoskeletu, DNA a mitochondrií Osmotická lýza, apoptóza Obr. 1-3: Mechanizmus excitotoxicity. Skratky: Kainate: Kainate receptor; NMDA: N-metyl-D-aspartát (receptor); AMPA: kyselina L-a-amino-3-hydroxy-5-metylizoxazol-4-propiónová kyselina (receptor); mglu: metabotropný glutamátový receptor; PLC: fosfolipáza C; IP 3: inozitol trifosfát; DAG: Diacylglycerol Diskutuje sa tiež o tom, že aterosklerotické zmeny v mozgových cievach vyvolané homocysteínom môžu viesť k ischémii a hypoxii, a tým k poškodeniu neurónov. 77. Je tiež podozrenie, že cysteín spôsobuje neurotoxické účinky vo vyšších koncentráciách prichádzajú, keď je hematoencefalická bariéra alebo bariéra krvných tekutín poškodená infiltráciou s nádormi alebo ožarovaním a väčším množstvom cysteínu sa môže dostať z krvi do CNS.

29 Page 16 Úvod majú podobné ako MTX a sú tiež schopné priamo inhibovať enzýmy biosyntézy purínov, majú veľký význam pre cytotoxicitu (toxíny). HNN NH 2 NN HOOC HNN NH 2 CH 3 O COOH MTX karboxypeptidáza aldehyd oxidáza HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 polyglutamát syntetáza kyseliny listovej HOOC HN HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 OO 2,4-diamino-N 10-metylpterová kyselina ( DAMPA) HNN COOH NH2 7-hydroxymetotrexát (7-OH-MTX) NN HOOC HNN NH2 CH3O CO (GLU) n metotrexát polyglutamát (MTX-PG) Obrázok 1-5: Metabolizmus MTX.

32 Úvodná strana 19 Glycínamid ribonukleotid (GAR) alebo 5-aminoimidazol-4-karboxamid ribonukleotid. 2- O3 PO CH 2 O PRPP OH OOOPOPO - OH O - O - OH 2 NH 2 NN AICAR N Ribose P 2-03 PO CH 2 OH O HN OH C CH 2 O GAR NH 2 AICAR-TF X MTX-PG ON 10-FTHF THF GAR-TF MTX-PG XN 10-FTHF THF OH 2 N CH HN N FICAR N Ribóza PH 2 CCOHN CH O NH Ribóza P FGAR OH 2 O HN NN IMP N Ribóza P Obrázok 1-7: Interakcia MTX-PG s de novo syntézou purínových báz (vybrané kroky). Skratky: PRPP: a-5-fosforibozyl-1-pyrofosfát, GAR: glycínamid ribonukleotid, GAR-TF: GAR transformyláza, FGAR: formylglycínamid ribonukleotid, N 10-FTHF: N 10-formyl tetrahydrofolát, THF: tetrahydrofolát: 5, 4-karboxamid ribonukleotid, AICAR-TF: AICAR transformyláza, FICAR: 5-formamido-imidazol-4-karboxamid ribonukleotid, IMP: inozínmonofosfát.