Vyhodnotenie mikrovaskulárnej funkcie ľudského tukového tkaniva pomocou videomikroskopického protokolu

Zhrnutie

Videomikroskopické systémy sa používajú na štúdium funkčných vlastností izolovaných arteriol z tukového tkaniva v reakcii na fyziologické a farmakologické podnety. Táto technika môže byť použitá na vyšetrenie mikrovaskulárnych fenotypov v rôznych doménach tukového tkaniva u obéznych ľudí.

Abstrakt

Úvod

Naše laboratórium aplikuje videomikroskopiu na skúmanie vzťahu medzi obezitou a vaskulárnou dysfunkciou s dôrazom na účinky rôznych domén tukového tkaniva na vaskulatúru. Centrálna obezita s akumuláciou vnútrobrušného viscerálneho tuku je s najväčšou pravdepodobnosťou spojená s tvorbou adipocytokínov, metabolickými poruchami a kardiometabolickým rizikom. Predpokladá sa, že v týchto procesoch je významne zapojená dysfunkcia tukového tkaniva s nadmernou produkciou pro-aterogénnych cytokínov a dysregulácia adipokínov, ale určité regulačné molekuly a ciele liečby zostávajú väčšinou nezistené. 4 Mimochodom, na úrovni lokálneho tukového tkaniva bolo zriedenie kapilár a porucha prietoku krvi spojené s pseudohypoxiou tukového tkaniva a metabolickou dysreguláciou. Hypotéza, že sa kardiovaskulárne ochorenie vyvíja, je pravdepodobne výsledkom dysfunkcie tukového tkaniva. Pro-aterogénne mediátory uvoľňované z tuku, najmä v spojení so strednou/viscerálnou obezitou, pravdepodobne podporujú endotelovú dysfunkciu a vaskulárne zmeny patogénov, ktoré sa môžu lokálne prejaviť v tukovej vaskulatúre a detekcii pomocou tu opísanej metodiky. 5

Funkčné hodnotenie arteriol izolovaného tukového tkaniva je užitočným prístupom k pochopeniu patofyziológie a molekulárnych mechanizmov, ktoré prispievajú k vaskulárnej dysfunkcii pri ľudskej obezite. Na preskúmanie mechanizmov, ktoré prispievajú k dysfunkcii špecifickej pre tukové zásoby, sme použili metódy na testovanie vazodilatačných reakcií závislých od endotelu a nezávislých od nich z mikrovaskulatúry a hodnotíme expresiu rôznych regulačných kandidátov vo vzorkách viazaného viscerálneho a subkutánneho (SC) tukového tkaniva. Obézni jedinci v čase absolvovania bariatrickej chirurgie.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Protokol a tu opísané príklady boli schválené inštitucionálnou revíznou komisiou Bostonskej univerzity pre medicínu (IRB, protokol č. H-25644) a boli vypracované v súlade s Helsinskou deklaráciou. Všetky subjekty poskytli pred účasťou písomný súhlas.

1. Pripravte roztoky a mikroskopické kanyly

2. Pripravte reagencie

  1. pripravte acetylcholín (ah, 10 -2 M, zásobný roztok). 18,29 g sa rozpustí v 10 ml deionizovanej vody. Alikvotné množstvá zásobného roztoku (10 -2 M) sa uskladnia pri -80 ° C. Sériovo zriedené v deň experimentu, aby sa dosiahli nasledujúce pracovné koncentrácie: 10 -5, 10 -9, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M.
  2. Pripravte si papaverín (2 x 10 -2 M, zásobný roztok). 0,07517 g sa rozpustí v 10 ml deionizovanej vody. Pripravte 10 μl alikvotné časti zásobného roztoku a sériovo ich riedte pri -80 ° C, aby ste získali 10-4, 10 -5, 10 -6, 10-7 10-8 M v deň experimentu.
  3. Pripravte endotelín-1 (ET-1, 2 x 10-5 M, zásobný roztok). 50 μg endotelínu-1 sa rozpustí v 1 ml 1% BSA/PBS. Alikvotné množstvá zásobného roztoku (2 x 10 - 5 M) sa uložia pri -80 ° C. V deň experimentu sa zriedia, aby sa získala pracovná koncentrácia 10 - 10 M v deň experimentu.
  4. Činidlá skladujte buď pri -20 ° C, alebo pri -80 ° C v závislosti od typu mrazničky, ale nie dlhšie ako 6 mesiacov.

3. Odber tukového tkaniva a príprava ciev

4. Vyhodnotenie obéznej mikrovaskulárnej funkcie

Poznámka: Všeobecne možno vazodilatáciu závislú od tukového arterioláru od endotelu vyvolať ako odpoveď na fyziologické (indukované prietokom) a farmakologické stimuly (indukované Ach).

  1. Tokom sprostredkovaná vazodilatácia závislá od endotelu
    1. po natlakovaní sa zaznamená priemer tukovej arterioly v pokoji (Di). Toto sa nazýva kľudový základný priemer.
    2. Pred zúžením krvných ciev,

    55% pokojového základného priemeru (Dp) pridaním 1 ul endotelínu-1 (ET-1, 10 - 10 M) priamo do vane a čakaním 5 minút. Tento postup opakujte, kým nedosiahnete požadovaný

    5. Analýza a výpočet dát

    1. vypočítať vaskulárnu reaktivitu. Na vytlačenie údajov použite percentuálnu vazodilatáciu, zvážte základné rozdiely v priemere ciev a vypočítajte pomocou nasledujúcej rovnice:
      % Vazodilatácie (DT-Dp/Di-Dp) x 100 =
      kde DT je ​​zaznamenaný priemer v určitom okamihu (maximálny priemer), Dp je priemer zaznamenaný po pridaní vazokonstrikčného činidla (tj. ET-1 spôsobil zúženie priemeru) a Di je priemer, ktorý bol bezprostredne pred pridaním vazokonstrikčného činidla (priemer pokojovej základnej čiary). 9
    2. Definujte citlivosť na vazodilatáciu a vazokonstrikciu (reakcia na dávku) na agonistu ako koncentráciu Ach, papaverínu alebo ET-1, ktorá vyvoláva 50% maximálnej odpovede (EG50) definovanej parametrom sigmoidu a vynesie sa do grafu, ako už bolo opísané. 10
      POZNÁMKA: štúdie reprodukovateľnosti medzi pozorovateľmi vazodilatácie tukových mikrociev majú v našom laboratóriu vysoký korelačný koeficient (CC) 0,99 (n = 10 Schiffových experimentov).

    1. Expresné kontinuálne merania ako ± SEM znamenajú, že tieto majú tendenciu byť normálne distribuované. Analyzujte vaskulárnu reaktivitu u obéznych arteriol pomocou opakovanej obojsmernej ANOVA.
    2. Prípadne porovnajte oblasť pod krivkou (AUC) účinku pre kumulatívnu vazodilatáciu s odpoveďami na dávku medzi liečenými skupinami. Vo všetkých prípadoch zvážte možnosť Predplatné P je povinné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Reprezentatívne výsledky

    Naše laboratórium použilo videomikroskopiu na vyšetrenie vazodilatácie závislej a nezávislej od endotelu, ako aj vazokontraktilnej funkcie tukového tkaniva, izolovaných arteriol zo subkutánneho a viscerálneho tukového tkaniva od obéznych ľudí. Charakteristické experimentálne usporiadanie je znázornené na obrázku 1Azobrazené. Arterioly z tukového tkaniva sú suspendované medzi dvoma pipetami kapilárneho skla a zaistené stehmi v komore orgánu, ako na obrázku 1b.zobrazené. Ako je opísané vyššie v časti 5.1, arteriolárne odpovede možno potom hodnotiť vyšetrením cievy na základnej hodnote (obrázok 2A).), po ktorom nasleduje predbežné zúženie pomocou ET-1

    55% priemeru základnej čiary (obr. 2 b) a potom agonistami indukovaná vazodilatácia a relaxácia vaskulárneho lúmenu, ako je to na obrázku 2zobrazené.

    mikrovaskulárnej
    Obrázok 1: Štruktúra video mikroskopie. (A.) Obrázok znázorňujúci komponenty videomikroskopickej orgánovej komory. (B.) Obrázok arterioly ľudského tukového tkaniva pripevnenej medzi dvoma sklenenými kapilárnymi pipetami v komore orgánu. Schiffov priemer sa mení v reakcii na fyziologické a farmakologické podnety, ktoré je možné skúmať a kvantifikovať pomocou analytického softvéru a invertovanej kamery pripojenej k systému špecializovanej na tento systém. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

    funkcie
    Obrázok 2: Vizualizácia mikrovaskulárnej vazodilatácie tlakovou videomikroskopiou. (A.) priemer pokojových základných arteriol (priemer po pretlaku, bez agonistu alebo stimulácie: ut)) (B.) už zúžené priemery (indukované zúžené priemery po ET-1: Dp), (C.) Agonistom indukovaný pokles priemeru (po pridaní Ach: DT). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

    funkcie
    Obrázok 3: Vazodilatácia závislá a nezávislá od endotelu u arteriol subkutánneho vs. viscerálneho tukového tkaniva u ľudí s nadváhou. Vazodilatácia závislá od endotelu sa signifikantne utlmila viscerálne v porovnaní so subkutánnymi tukovými arteriolmi o (A.) Posúdenie zvýšeného prietoku (spárované subkutánne a viscerálne cievy, n = 20) alebo (B.) Odozva na dávku acetylcholínu s/bez L-NAME (spárované subkutánne a viscerálne cievy, n = 16). (C.) Vazodilatácia nezávislá od endotelu sa pri hodnotení reakcie na dávku papaverínu rozdielne medzi viscerálnymi a subkutánnymi arteriolmi nezmenila (spárované subkutánne a viscerálne cievy, n = 8). * Označuje skupinové rozdiely medzi skladmi; † Označuje Depotovo špecifické rozdiely medzi acetylcholínom s L-NAME v porovnaní so samotným acetylcholínom; NS: nevýznamné. Dáta sú uvedené ako priemer ± SEM, vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    Pitva a izolácia obéznych arteriol z okolitých tkanív môže byť procesom náročným na čas a prácu s dôkladnou pozornosťou venovanou detailom a technickému protokolu. Mikrodisekčný postup vyžaduje starostlivé zručnosti a špecializované vybavenie na disekciu, aby sa zabránilo možnému poškodeniu hladkého svalstva alebo endotelových vrstiev mikrovaskulatúrnej bunky. Aj najmenší náhodný vpich do steny artérie môže zabrániť intraluminálnemu natlakovaniu a vyústi do neúspešného pokusu. Okrem toho je kanylácia arteriol pomocou stehov nevyhnutná na zaistenie arteriol medzi hrotmi pipety so sklenenou kapilárou na každom konci cievy.

    Ľudské izolačné mikroobvody môžu vyvinúť spontánny myogénny tonus po 30-40 minútach tlaku pri 60 mmHg. Zistili sme však, že veľkosť ľudských tukových arteriol je obvykle 50 - 350 um s vnútorným priemerom lúmenu relatívne malá s riedkymi vrstvami buniek hladkého svalstva ciev a nemá tendenciu vyvíjať významný myogénny tonus v porovnaní s arteriolmi kostrového svalstva. Teda spúšťame predbežné zúženie týchto malých arteriol pomocou ET-1 pred expozíciou vazodilatátorom. Zistili sme, že ET-1 vykazuje spoľahlivejšiu vazokonstrikčnú odpoveď, zatiaľ čo v niektorých prípadoch môže existovať variabilita v reakciách na agonisty alfa receptora, ako je fenylefrín. Na vyvolanie požadovaného je bezpodmienečne potrebné použiť vhodného agonistu

    55% predbežné zúženie na výber; Je však tiež dôležité zvoliť správne množstvo predkonstrikčného činidla pred dávkovaním a zabrániť toxickému poškodeniu cievy. Za týmto účelom začneme spodným dávkovacím riadkom a titrujeme podľa pokynov v časti 4.1.2.

    Arterioly v tukovom tkanive sú citlivé na zmeny pH a teploty; 14 je preto rozhodujúce monitorovať a regulovať vhodné pH (7,4) a teplotu (37 ° C) počas experimentálneho postupu. Aj keď videomikroskopia má prísne kontrolovanú teplotu, je nevyhnutné v experimente monitorovať pH roztoku, aby sa zabránilo posunom, ktoré môžu skresliť výsledky. Nepretržité bubliny roztoku RAKOVINA a náhradného roztoku každých 15 minút počas krokov tlakovania a umývania znížia kolísanie pH v priebehu času.

    Videomikroskopia je užitočná metóda na štúdium funkčných vlastností mikrovaskulatúry. Táto technika má významnú krivku učenia a je potenciálne náročná na prácu, najmä počas procesu vaskulárnej izolácie. Naše skúsenosti s mikrovaskulatúrou tukového tkaniva v závislosti od typu biopsie tkaniva ukazujú, že postup kanylácie môže trvať značné množstvo času a trpezlivosti. Experimenty majú navyše svoju vlastnú časovú citlivosť, pretože cievy mimo tela majú tendenciu časom strácať svoje fyziologické a funkčné vlastnosti. Preto musia byť experimenty uskutočňované v rámci životaschopných okien ciev niekoľko minút až hodín po chirurgickej biopsii pred akýmkoľvek rozpadom tkaniva.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Zverejnenie

    Autori nemajú žiadne správy ani konflikty záujmov.

    Poďakovanie

    Autori by chceli poďakovať dobrovoľníkom za účasť na týchto štúdiách a personálu operačnej sály v Boston Medical Center za poskytnutie biopsie tukového tkaniva. DR. Gökce je podporovaná z grantov Národných inštitútov zdravia (NIH), HL081587, HL114675 a HL126141. DR. Farba sa spolieha na grant NIH K23 HL135394.