Diferenciačná kapacita protokolu o progenitorových bunkách ľudských aortálnych perivaskulárnych tukových buniek (preložené)

Zhrnutie

Cieľom tohto protokolu je testovať schopnosť progenitorových buniek pochádzajúcich z ľudského perivaskulárneho tukového tkaniva diferencovať sa do viacerých línií bunky. Diferenciácia sa porovnávala s mezenchymálnymi kmeňovými bunkami z ľudskej kostnej drene, o ktorých je známe, že sa diferencujú na bunkové línie adipocytov, osteocytov a chrupaviek.

Abstrakt

Úvod

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Použitie ľudských tkanív v tejto štúdii bolo posúdené a schválené komisiou pre inštitucionálne preskúmanie v Maine Medical Center a všetci pracovníci boli pred experimentmi primerane vyškolení.

2. Protokol 1: Kultivácia ľudských PVAT buniek zo stromálnej vaskulárnej ruptúry

Poznámka: PVAT sa resekuje z miesta anastomózy štepu do vzostupnej aorty u pacienta v anestézii s koronárnou bypassovou angioplastikou. Aortálna PVAT sa umiestni do 15 ml kužeľa s 10 ml ľadovo studeného vysoko glukózového DMEM-F12 a prenesie sa do laboratória z operačného sálu do 2 hodín po resekcii. Aortálny PVAT je vyhodené tkanivo počas procedúr bypassu a je vedený ako interný audit oddelenia Maine Medical Center ako výskum subjektov iných ako človek.

    Tento protokol je pre a

500 mg kusu ľudského PVAT (približne 3 x 1 x 0,5 cm 3). Preneste čerstvý ľudský PVAT z DMEM do 50 ml kónickej skúmavky obsahujúcej 25 ml roztoku antibiotika. Inkubujte s rockigénom 20 minút pri 4 ° C. Keď je PVAT v roztoku antibiotika, rozmrazte alikvotný podiel disociačného tlmivého roztoku pri 37 ° C. Pridajte 5 ml disociačného pufra 50 ul 100 X antibiotikum/protiplesňový roztok a sterilizujte pomocou 0,22 µm injekčného filtra. 1 tiež pridajte 1 ml želatínového roztoku z 24-jamkovej doštičky. V digestore s laminárnym prúdením použite sterilné pinzety a nožnice na prenos PVAT z roztoku antibiotika do sterilnej Petriho misky. Pridajte 1 ml predhriateho disociačného tlmivého roztoku do tkaniva a jemne nakrájajte celé tkanivo na kašu (žiadny kúsok väčší ako

Pridajte 1 ml čerstvého kultivačného média a distribuujte 500 ul, 2 jamky z 24-jamkovej doštičky, každá s 500 ul rastového média a 25 ng FGF2.

  • Tiež bunky získané z ľudského PVAT pokračujú v expanzii, ako je uvedené v predchádzajúcom kroku. Každý priechod by nemal byť väčší ako rozdelenie 1: 2. Bunky sa pasážujú 5 až 7 krát predtým, ako sa rozdelia na diferenciačné testy.

    • 3. Protokol 2: Kultivácia kolónií MSC ľudskej kostnej drene

    Poznámka: MSC z ľudskej kostnej drene sa izolovala, ako je opísané 8, a skladovala sa ako zásoby včasného prechodu v zmrazenom zmrazovacom médiu (70% FBS, 20% bazálny DMEM a 10% DMSO).

    100 000 buniek/ml v kvapalnom N2.

    1. Injekčnú liekovku s MSC kostnej drene rýchlo rozmrazte z kvapalného N2 vo vodnom kúpeli s teplotou 37 ° C a doštičku do jamky 6-jamkovej kultivačnej doštičky s 3 ml rastového média MSC a inkubujte cez noc pri 37 ° C a 5% CO2.
    2. Nasledujúci deň odsajte kultivačné médium MSC a bunky 3x premyte v 2 ml HBSS. Pri 100% sútoku odsajte rastové médium a bunky 3x premyte v 2 ml HBSS. Pridajte 500 ul/jamku roztoku na oddeľovanie buniek a inkubujte 5 minút pri 37 ° C a 5% CO2. Poklepte na doštičku, aby ste zabezpečili vytesnenie všetkých buniek a obsah v 6-jamkovej doštičke s 2 ml rastového média MSC rovnomerne v 2 jamkách distribuovať.
    3. Expandujte v ľudskej kostnej dreni a MSC odvodenom z PVAT paralelne približne o 5 - 7 pasáží alebo kým sa nedosiahne dostatočné množstvo na testovanie.

    4. Protokol 3: Doska a indukcia adipogénnych, osteogénnych a chondrogénnych línií

      Zodpovedajúci počet doštičiek kostnej drene a PVAT buniek získaných na jamku 12-jamkovej doštičky a replikovaných primerane pre každú experimentálnu podmienku. Pre adipogénne a osteogénne podmienky,

    5. Protokol č. 4: Kultúra adipogénnych, osteogénnych a chondrogénnych línií po dobu 14 dní

    6. Protokol č. 5: farbenie adipogénneho stavu olejovo červenou O

    7. Protokol 6: farbenie osteogénneho stavu alizarínovou červenou

    1. Z každej jamky odstráňte všetku tekutinu. Pridajte príslušné objemy 2% roztoku na farbenie alizarínovou červenou do každej jamky (1,5 ml na jamku pre 12-jamkovú doštičku) a jemne nakláňajte doštičku zo strany na stranu, až kým roztok úplne nezakryje dno jamky.
    2. Inkubujte 15 minút pri izbovej teplote. Odstráňte alizarínovú červeň z jamky. Každú jamku vypláchnite štyrikrát destilovanou vodou, pričom dávajte pozor, aby ste jemne nevytlačili kryštály vápnika. necháme zaschnúť.

    8. Protokol 7: Farbenie chondrogénneho stavu Massonovým trichrómom

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Reprezentatívne výsledky

    Izolácia vaskulárnej frakcie stromálnych buniek z ľudského PVAT

    Obrázok 1A ukazuje schematické znázornenie anatomickej oblasti, ktorá bola určená nad PVA vo vzostupnej aorte. Skupiny pacientov v operácii koronárneho bypassu, tieto vzorky odvodené od 6, boli predtým opísané - obrázok 1b ukazuje príklad ľudského PVAT získaného po chirurgickom zákroku. ilustrácia 1 ukazuje reprezentatívny rez látkou PVAT zafarbenou farbením Masson Trichrome. ilustrácia 1 je mikrofotografia fázovej kontrakcie ukazujúca populáciu stromálnych buniek derivovaných z PVAT počas expanznej fázy pred diferenciáciou. Bunky je možné rozšíriť a zmraziť pre ďalšie použitie. Bunky majú obvykle hustotu 2,5 x 105 buniek/ml v médiu pozostávajúcom zo 70% zmrazeného FBS, 20% bazálneho (bez antibiotík) DMEM-F12 a 10% DMSO v izopropanolovej komore. 80 ° C po dobu 24 hodín a presunula sa do kvapalnej fázy mrazničky s kvapalným N2 na dlhodobé skladovanie.

    Adipogénna diferenciácia

    MSC paralelne s ľudskou kostnou dreňou (obr. 2AB.) a progenitorové bunky derivované z PVAT (obrázok 2D.) boli vykonané štúdie. Ľavé panely na obrázku 2 ukazujú indukovaný stav, pri ktorom nie je evidentná akumulácia lipidov. Správne doštičky zobrazujú bunky diferenciáciou adipocytov a farbením neutrálnych lipidov olejovou červenou O. Zatiaľ čo stupeň diferenciácie v ľudskej aortálnej chlopni je v bunkách odvodených z PVAT robustnejší, oba zdroje preukázali schopnosť ľudskej bunky diferencovať sa v smere adipogénnej línie.

    Osteogénna diferenciácia

    Protokol o osteogénnej diferenciácii sa použil na MSC pochádzajúcu z ľudskej kostnej drene (obr. 3A-C.) a bunky odobraté PVAT (obrázok 3D- F) sa používa. Neindukované bunky (obr. 3AD.) nezafarbujte na červeno alizarínom. Podľa protokolu o osteogénnej diferenciácii sa u ľudského MSC vyvinuli kalcifikované uzliny, ktoré boli zafarbené na červeno alizarínom (obr. 3b).- C.), zatiaľ čo bunky derivované z PVAT z ľudskej aorty nie (Obrázok 3E-F.). Tieto údaje naznačujú, že našej príprave buniek zo stromálnej vaskulárnej ruptúry ľudského PVAT chýba početný predok so schopnosťou podstúpiť osteogenézu. V závislosti od štúdie a časového priebehu diferenciácie je vhodné sledovať štandardné škvrny s detekciou molekulárnych markerov, ktoré definujú postihnutie línie tvoriacej kosti (napr. RUNX2, Osterix, alkalická fosfatáza) alebo osteoblastov (osteopontín, osteokalcín, alkalická fosfatáza, BAP1).

    Chondrogénna diferenciácia

    Bunky z MSC ľudskej kostnej drene (obr. 4A) odvodený a ľudský PVAT (obrázok 4b) vykazujú znaky charakteristické pre chondrogénnu diferenciáciu s hojnou akumuláciou kolagénu v mikromase. Mikromasy vytvorené z MSC ľudskej kostnej drene a buniek derivovaných z aorty PVAT tiež vykazovali hojnú akumuláciu glykozaminoglykánov (modrá), čo naznačuje farbenie alciánovou modrou (obrázok 4)-D., v uvedenom poradí). Morfologicky boli štruktúry podobné medzerám so sedením v dutinách vytvorených ukladaním kolagénu (obrázok 4, Šípky) obklopujúce bunky. V závislosti od štúdie a časového priebehu diferenciácie je užitočná detekcia určitých chondrogénnych markerov (agrekán, kolagén typu II, osteonektín, Sox9).

    kapacita
    Obrázok 1: Morfologické charakteristiky ľudského PVAT. (A.) Kreslené znázornenie ľudskej aorty (červená) s okolitým PVAT (žltá). Šípka ukazuje vzostupnú aortu. (B.) 480 mg kúsok PVAT z ľudskej aorty od pacienta s CABG v DMEM pred disociáciou. (C.) Massonovo formalínom fixované parafínom zaliate humánne PVAT trichrómové farbivo (tmavohnedé/čierne = jadrá, modré/fialové = spojivové tkanivo, ružové = cytoplazma; všimnite si, že červené krvinky vyzerajú červeno-ružovo. (D.) Reprezentatívny obraz explantovaných stromálnych buniek PVAT počas 7 dní v kultúre. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

    diferenciačná
    Obrázok 2: adipogénna diferenciácia. (A.) Fázová mikroskopia MSC ľudskej kostnej drene v neindukovanom stave nepreukazuje žiadny dôkaz diferenciácie. (B.) Fázová mikroskopia MSC ľudskej kostnej drene v indukovanom adipogénnom stave ukazuje určitú diferenciáciu a imobilizáciu neutrálnych lipidov zafarbených olejovou červenou O po 14 dňoch. (C.) Fázová mikroskopia ľudských buniek aorty odvodených od PVAT v neindukovanom adipogénnom stave nepreukazuje žiadny dôkaz diferenciácie. (D.) Fázová mikroskopia ľudských buniek aorty odvodených z PVAT v indukovanom adipogénnom stave ukazuje silnú diferenciáciu a imobilizáciu neutrálnych lipidov zafarbených olejovou červenou O po 14 dňoch. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

    kapacita
    Obrázok 4: Chondrogénna diferenciácia. (A, B) Svetelná mikroskopia časti mikromasy tvorenej ľudskými kostnými dreňmi MSC (A) alebo ľudskými progenitorovými bunkami PVAT progenitorových buniek (B) v indukovanom chondrogénnom stave po 14 dňoch kultivácie a následne zafarbená Masson Trichrome, čo naznačuje významné ukladanie kolagénu (modrá) a naznačuje úspešnú diferenciáciu na chondrogénnu líniu. (C, D) Svetelná mikroskopia časti mikromasy tvorenej ľudskou kostnou dreňou MSC (C) alebo prekurzorovými bunkami PVAT ľudskej aortálnej chlopne (D) v indukovanom chondrogénnom stave po 14 dňoch kultivácie a potom zafarbená modrou farbou alciánom, čo naznačuje ukladanie kyslých proteoglykánov (napr. B. glykozaminoglykány), ako sa zvyčajne nachádzajú v chrupavke. Protifarbenie, jadrová červená rýchlo; Šípky, medzery podobné štruktúry. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    Kmeňové bunky z tukového tkaniva sa stali zameraním na aplikácie regeneratívnej medicíny vďaka ľahkému prístupu a vysokému počtu buniek, ktoré je možné odvodiť z tukového tkaniva 12, 13. Cievne bunky, zápalové bunky, fibroblasty, preadipocyty a kmeňové bunky z tukového tkaniva sú vaskulárnou časťou tukového tkaniva stromálnych buniek. Existujú rozdiely v populácii kmeňových buniek založené na anatomickom umiestnení zásobníka tukového tkaniva a vlastnostiach adipocytov 14. Najdôležitejšie je, že sa zdá, že kmeňové bunky derivované z tukového tkaniva sú schopné diferencovať nielen v mezenchymálnych líniách 15, ale aj potenciál predpokladať neurónové 16, 17 a epidermálne 18 osudy.

    Mnoho štúdií sa zameralo na kmeňové/progenitorové bunky odvodené z ľudského podkožného bieleho tukového tkaniva, ale len málo štúdií sa zaoberalo vlastnosťami progenitorových populácií PVAT. Posledné štúdie izolovali progenitorové bunky adipocytov z PVAT obklopujúcich mezenterické cievy alebo hrudnú aortu potkana. Zatiaľ čo sa tieto populácie CD34 +/CD140a + diferencujú na adipocyty, schopnosť kresliť ďalšie línie sa netestovala 19 .

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Zverejnenie

    Autori nič neprezradili.

    Poďakovanie

    Uznávame podporu navigačného výskumu v Maine Medical Center pri pomoci pri získavaní klinického tkaniva a histopatologického a histomorfometrického jadra (podporované 1P20GM121301, L. Liaw PI) vo Výskumnom ústave pre rezanie a farbenie v Maine Medical Center. Túto prácu podporil NIH Grant R01 HL141149 (L. Liaw).