Evolučné zmeny v používaní redoxaktívnych aminokyselín a ich príčiny - PDF zadarmo
Evolučné zmeny v používaní redox-aktívnych aminokyselín a ich príčiny Evolučná variabilita v použití redoxaktívnych aminokyselín: príčiny a dôsledky Dizertačná práca pre získanie titulu doktora prírodných vied na Biologickej fakulte Univerzity Johannesa Gutenberga v Mainzi, ktorý predniesol Mario Schindeldecker narodený dňa 20. decembra 1978 v inzeráte Rodalben Rodalb Mainz, 2014
Dekan: 1. recenzent: 2. recenzent: Deň ústnej skúšky: 03.06.2015
Obsah Zoznam skratiek. IV 1 Úvod. 1 1.1 Oxidačný stres. 1 1,2 mitochondrie. 1 1.2.1 Štruktúra a funkcia. 2 1.2.2 Mitochondriálny dýchací reťazec a oxidatívna fosforylácia. 4 1.2.3 Odchýlky od univerzálneho genetického kódu. 11 1.3 Teória starnutia voľnými radikálmi. 12 1.3.1 Reaktívne formy kyslíka. 12 1.3.2 Mitochondriálna teória voľných radikálov starnutia. 14 2 Problémy a ciele. 17 3 materiál. 18 3.1 Záznamy o bielkovinových údajoch. 18 3.1.1 Životnosť, telesná hmotnosť a bielkovinové sekvencie skúmaných druhov zvierat. 18 3.1.2 Sekvencie ľudských bielkovín v jednotlivých kompartmentoch. 20 3.1.3 Jadrové a mitochondriálne kódované podjednotky komplexov dýchacích reťazcov. 21 3.2 Počítačové programy a softvérové balíčky. 21 3.3 Špeciálne chemikálie. 21 3.4 Zoznam zariadení. 22 3.5 Bunková kultúra. 23 3.5.1 Klonálne bunky. 23 3.5.2 Primárne bunky. 23 3.6 Médiá a riešenia pre bunkovú kultúru. 23 3.7 Riešenia pre biochemické a bunkové biologické testy. 24 3.8 Pufre a roztoky na analýzu bielkovín a lipidov. 24 3.9 Protilátky. 27 4 Metódy. 29 4.1 Bioinformatické analýzy. 29 4.1.1 Frekvencia používania aminokyselín v proteínových sekvenciách. 29 4.1.2 Identifikácia membránových oblastí. 29 4.2 Bunková kultúra. 29 4.2.1 Stanovenie bunkového veku buniek IMR90. 29 I.
Zoznam skratiek 2SH mercaptoetanolu 4SH 1-butanthiolu 8SH 1 oktanthiol 10SH 1-dekanthiolu 12SH 1-dodekanthiol 14SH 1-tetradecanethiol 18SH 1-octadecanethiol Abami mix antibiotikum-antimykotikum zmes amoniakálneho ammonate, AchE acetylcholínesterázy AA catalanethiol, AChE, acetylcholínesterázy AA, AChE, acetylcholín trojfázové, AChE, acetylcholín trojfázové, AChE, acetylcholín trojfázové, AChE, acetylcholín trojfázové, AChE, catalosulphase, AChE, catalosulphase, AChE, acetylcholín trojfázové, AChE, catalosulphase, AChE, aacetylcholine trojfázové, AChE, je catalosulphase, a. kataláza CYS cysteín ddH2O dvakrát destilovanej vode z kyseliny 3-merkaptopropionové DHA kyseliny dokosahexaenovej DMEM Dulbecco modifikovanom Eaglovho média DMS Dodecylmethylsulfid DMSO dimetylsulfoxid DNA deoxyribonukleová kyselina DOH 1-dodekanol DPBS Dulbecco fosfátom pufrovaný fyziologický roztok CstF štiepenie stimulácia faktora DTT dithiothreitol EDTA etyléndinitriltetraoctová ER endoplazmatického retikula prenos ETF elektrónov kruhového flavoproteínov EtOH etanol FBS/FCS fetálne hovädzie/teľacie sérum, fetálne hovädzie sérum FMN flavín mononukleotid GRáza glutatión reduktáza IV
GSH glutatión GPX glutatiónperoxidáza h hodiny (hodiny), hodina (hodiny) H2O2 peroxid vodíka HRP chrenová peroxidáza, chrenová peroxidáza MAM mitochondrie asociovaná ER membrána MEM NEAA minimálne základné médium, neesenciálne aminokyseliny MTS mitochondriálna cieľová sekvencia M molárne min. Minúty mtdna mitochondriálna deoxyribonukleová kyselina Msr metionínsulfoxidreduktáza MTT 3- (4,5-dimetyltiazolyl-2) -2,5-difenyltetrazóliumbromid MUFA mononenasýtené mastné kyseliny, mononenasýtené mastné kyseliny mmn millukimolar mw milliwatt µg adenum NADPH nikotínamid adenín dinukleotid fosfát NOX NADPH oxidáza NaN3 azid sodný nm nanometer Oxa1 mitochondriálna oxidáza montážny proteín 1 STRÁNKA polyakrylamidová gélová elektroforéza zdvojnásobenie populácie PUFA (polynenasýtené mastné kyseliny) RNA, polynenasýtené mastné kyseliny RNA, RT pri teplote miestnosti polynenasýtená ribonukleová kyselina ribonukleová kyselina reaktívne formy kyslíka, reaktívne Sa ustoffspies SDS dodecylsulfát sodný, dodecylsulfát sodný SOD superoxiddismutáza SRP rozpoznávanie signálu častica V
t12sh terc-dodekántiol TBARS reaktívne látky s kyselinou tiobarbiturovou, reaktívne látky s kyselinou tiobarbiturovou TEMED N, N, N ', N'-tetrametyletyléndiamín TFA trans mastné kyseliny, trans mastné kyseliny TM transmembránový TOC α-tokoferol, vitamín E TOM translokátor vonkajšej membrány trna Transfer-RibXonu Tioredoxín TWEEN polysorbát VDAC napäťovo závislý aniónový kanál VI
Úvod Obrázok 5: Prehľad reakcií reaktívnych foriem kyslíka a nitro-druhov v mitochondriách a ich dôsledky. Prevzaté zo Smith et al., 2003. Toxicitu superoxidu v mitochondriálnej matrici je možné študovať u mitochondriálnych Mn-SOD knockoutovaných myší, ktoré prežili iba medzi 10 a 20 dňami aj v prítomnosti antioxidantov (Lebovitz et al., 1996; Li a kol., 1995). Naproti tomu vyradenie cytosolického Cu/Zn-SOD nie je smrteľné, aj keď tieto zvieratá vykazujú mierne zvýšenú citlivosť na ROS (Ho et al., 1998), čo naznačuje, že extramitochondriálny superoxid je menej toxický. Charakteristikou celoživotnej akumulácie proteínov a lipidov poškodených oxidáciou je striktne na veku závislý výskyt lipofuscínu, nedegradovateľné ukladanie lipofilných agregovaných proteínov (30 - 58%) a lipidov (1951%) v postmitotických bunkách (Porta, 2002). Lipofuscín sa vyskytuje obzvlášť silno v srdcovom svale a nervových bunkách, ako aj v pigmentovom epiteli sietnice. V súhrne možno progresívny priebeh starnutia vysvetliť pomocou tejto teórie nasledovne: V priebehu starnutia sa oxidované bielkoviny neustále hromadia. Oxidácia 16
Materiál 5 ml pyruvát (100 mm) 5 ml MEM NEAA (100 mm) 3,7 Roztoky pre biochemické a bunkové biologické testy Roztok MTT (roztok 3- (4,5-dimetyltiazolyl-2) -2,5-difenyltetrazóliumbromidu: 5 mg/ml MTT v ddh2o solubilizačnom roztoku MTT: 40% (hm./obj.) dimetylformamid 10% (hm./obj.) dodecylsulfát sodný pH 4,0 (ľadová kyselina octová) 3,8 pufre a roztoky na analýzu proteínov alebo lipidov 10x fyziologický roztok pufrovaný fosfátom (PBS): 1,37 M NaCl 27 mm KCl 100 mm Na2HPO4 x H2O 18 mm KH2PO4 ph 7,4 Fosfátom pufrovaný soľný roztok s TWEEN-20 (PBS-T): 1x PBS 0,05% (v/v) TWEEN-20 ph 7.4 Pufr na zber buniek (lyzačný pufor) bez SDS: 24
Materiál 50 mm Tris-HCl 10% sacharóza 1 mm EDTA 1 mm EGTA 15 mm HEPES 1 mm orthovanadičnan sodný 1 mm inhibítor NaF proteinázy 1: 100 (Sigma-Aldrich) inhibítor fosfatázy 1: 100 (Sigma-Aldrich) ph 6,8 4x plniaci tlmivý roztok (Tlmivý roztok pre vzorky) pre SDS-PAGE: 200 mm Tris-HCl, ph 6,8 8% (hm./obj.) SDS 40% (hm./obj.) Glycerol 0,02% (hm./obj.) Brómfenolová modrá 20% (v/v) v) β-merkaptoetanol 10x bežný tlmivý roztok pre SDS-PAGE: 250 mm Tris báza 2,5 M glycín 1% (hm./obj.) SDS pH 8,3 separačný gél pre SDS-PAGE: 0,375 M Tris-HCl, pH 8, 8 10% (hm./obj.) Akrylamid/bisakrylamid (29: 1) 0,1% (hm./obj.) SDS 0,05% (obj./obj.) TEMED 25
Materiál 0,1% (hmotn./obj.) APS stohovací gél pre SDS-PAGE: 0,15 M Tris-HCl, pH 6,8 3% (hmotn./obj.) Akrylamid/bisakrylamid (29: 1) 0,1% ( w/v) SDS 0,05% (v/v) TEMED 0,1% (w/v) APS 10x prenosový pufer: 250 mm báza Tris 2,5 M glycín Pridanie 20% metanolu k 1 x zriedeniu 1 x Ponceau S.: 0,2% (hm./obj.) Ponceau S 5% (obj./obj.) Tlmivý roztok blokujúci kyselinu octovú: 5% (hm./obj.) Sušené sušené mlieko (bez tuku) v PBS-T neredukujúci lipidový pufor (odplynený): 20 mm TRIS, ph 7,4 1 mm MgCl2 5 mm KCl 26
Materiálový pufor na analýzu mastných kyselín: 1x PBS 10 um fenotiazín 1 mm DTT 1 mm EDTA Luminol vývojové roztoky: A: 0,1 M Tris-HCl, pH 8,6 0,025% luminol B: 0,11% kyselina para-kumarová v DMSO C: 30% H2O2 TBARS testovací zastavovací roztok: 5% kyselina trichlóroctová v 1 M ľadovej kyseline octovej 0,5% kyselina tiobarbiturová v 10 mm NaOH 3.9 Protilátky Použité protilátky sa zriedili v PBS-T na nižšie uvedené koncentrácie. Ďalej sa k primárnym protilátkam pridalo 0,05% azidu sodného (NaN3). Výrobca protilátok anti-hsp70 (1: 1000) stresový gén, USA anti-hsp90 (1: 1000) stresový gén, USA anti-p21 (1: 500) BD Biosciences, USA anti-p53 (1: 1000) Abcam, USA anti-p62 (1: 500) Santa Cruz Biotechnology, USA anti-polyubiquitin (1: 1000) Dako, Denmark anti-tubulin (1: 1000) Sigma-Aldrich, Germany Tabuľka 6: Primárne protilátky 27
Materiál Protilátka Výrobca Esel anti-mouse-hrp (1: 10 000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, USA Esel anti-rabbit-hrp (1: 10 000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, USA Tabuľka 7: Konjugáty sekundárnych protilátok a HRP 28
Výsledky Obrázok 7: Pomery distribúcie aminokyselín medzi peroxizomálnymi a bunkovými proteínmi u 4 druhov (zľava doprava: Homo sapiens, Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus). 5.1.2 Porovnanie mitochondriálnych a bunkových proteínov Ako modely dva a tri sa použil pomer využitia aminokyselín v mitochondriálne kódovaných proteínoch v porovnaní s bunkovými proteínmi alebo mitochondriálne kódovanými proteínmi v porovnaní s mitochondriálne lokalizovanými proteínmi (obrázok 8 a obrázok 9). Niektoré zvláštnosti mitochondrie sú, že sa považuje za hlavné miesto výroby oxidačných druhov kyslíka (Brand, 2010), a že v mitochondriálne kódovaných proteínoch komplexu I je redoxaktívna aminokyselina cysteín vyčerpaná v závislosti na dĺžke života (Schindeldecker et al., 2011), zatiaľ čo to Redox-aktívny metionín sa tam tiež obohacuje bez ohľadu na maximálnu dĺžku života (Bender et al., 2008). Toto robí z mitochondrií prominentný model, na ktorom je možné študovať evolučné adaptácie na oxidačný stres a možnú výslednú diferencovanú frekvenciu používania aminokyselín. 39
Výsledky Použite KLMNPQRSTVWY Aerobicita (V) 1,39 1,01 1,51 1,16 1,63 1,77 1,04 0,93 1,68 0,58 1,03 0,68 5E-05 6E-01 2E -06 1E-02 5E-09 9E-12 2E-01 5E-05 1E-09 3E-12 6E-01 2E-11 Tabuľka 12: Model V: Frekvencia používania aminokyselín v mitochondriálne kódovaných proteínoch dýchacieho reťazca vo voľnom živote, aeróbne verzus parazitárne, anaeróbne červy. (jednosmerná, neparametrická analýza variancie s dvoma kategóriami). * Pojem kŕmna dávka popisuje pomer stredných hodnôt. Ak sa porovná diferencované použitie aminokyselín v mitochondriálne kódovaných proteínoch dýchacieho reťazca medzi aeróbnymi a anaeróbnymi červami, je zrejmé, že cysteín vykazuje najväčšiu strednú zmenu vo forme vyčerpania (tabuľka 12). Najvyššiu dôležitosť však vykazuje histidín, ktorý je preto spôsobený nízkym rozptylom dátových bodov. Frekvencia použitia metionínu na druhej strane ukazuje vysoký rozptyl v rámci skúmaných druhov zvierat, ktorý v kombinácii s vysokou strednou odchýlkou poskytuje priemernú štatistickú významnosť. Pretože disperzia aminokyseliny valín je malá, vedie k najvýznamnejšej zmene v tomto modeli. 49
Výsledky na oxidovateľnom substráte, ktorý inhibuje alebo spomaľuje jeho oxidáciu (Halliwell, 1990). Je potrebné poznamenať, že okrem oxidovateľných aminokyselín môžu ako substráty slúžiť aj cukor, DNA a lipidy. Je obzvlášť zaujímavé, že metionín sa hromadí v proteínoch vnútornej mitochondriálnej membrány, čo je biologicky spôsobené prítomnosťou dvoch metionínových kodónov v mitochondriálne kódovaných proteínoch dýchacieho reťazca. Predpokladalo sa, že akumulácia metionínu v týchto proteínoch a s tým spojené zdvojnásobenie kodónu metionínu v mitochondriálnej DNA je príčinne spôsobené produkciou a zvýšeným výskytom ROS v tejto organele alebo kompartmente (Bender et al.). ., 2008). Preto bolo zaujímavé preskúmať použitie metionínu v rôznych kompartmentoch alebo oblastiach ľudskej bunky, aby sa zistilo, či je možné pri použití tejto aminokyseliny nájsť topologicky špecifickú frekvenciu. Výsledkom bolo, že ľudské proteínové sekvencie z rôznych subcelulárnych oblastí boli analyzované na obsah metionínu. 52
Výsledky 5.2.1 Porovnanie použitia metionínu v rôznych subcelulárnych oblastiach Obrázok 10: Použitie metionínu v ľudských proteínoch v rôznych subcelulárnych oblastiach. Každá vertikálna čiara symbolizuje jeden proteín, ktorého poloha zodpovedá stupňu použitia metionínu v distribučnej krivke znázornenej nižšie. Zelené čiary zodpovedajú príslušnému priemeru, červené čiary zodpovedajúcemu mediánu použitia metionínu v skúmaných kompartmentoch. Spojitá zvislá čiara označuje globálny medián všetkých proteínových sekvencií skúmaných v roku 19806. Obrázok 10 zobrazuje štatistickú distribúciu metionínu v ľudských proteínoch v rôznych subcelulárnych oblastiach. Nasledujúce skratky boli použité na obrázku 10 a v tabuľke 14 53
Výsledky Porovnanie štyroch komplexov dýchacích reťazcov I, III, IV a V, v ktorých podjednotky pochádzajú ako z jadra, tak aj z mitochondrie samotného, tiež ukazuje inú frekvenciu užívania metionínu. Komplex I pozostáva v priemere z 5,84% metionínu u všetkých skúmaných druhov zvierat, 2,64% u zvierat s jedným Met kodónom a 6,82% metionínu u zvierat s dvoma Met kodónmi; Komplex III vo všetkých z 3,79% metionínu, u zvierat s jedným Met kodónom od 2,30% a u zvierat s dvoma Met kodónmi od 4,24% metionínu. Komplex IV celkovo od 4,72%, u zvierat s jedným Met kodónom od 3,42% a u zvierat s dvoma Met kodónmi od 5,11% metionínu; Komplex V u všetkých druhov zvierat od 5,31%, u zvierat s jedným Met kodónom od 3,17% a u zvierat s dvoma Met kodónmi od 5,97% metionínu. Najväčší rozdiel v rámci rôznych komplexov je možné pozorovať v komplexe I. Medzi zvieratami s jedným Met kodónom a zvieratami s dvoma Met kodónmi je rozdiel vo frekvencii užívania metionínu 4,18%. 60
Výsledky Obrázok 12: Rýchlosť prežitia buniek HT22 po inkubácii s 1 um, 2 um, 5 um, 10 um, 20 um, 50 um, 100 um a 200 um CAM, DES, CYS a GSH po dobu 72 hodín (n> = 3). Vo vode rozpustné látky CAM, DES, CYS a GSH použité na obrázku 12 nevykazujú žiadny toxický účinok na bunky HT22 v žiadnej z koncentrácií použitých po inkubácii po dobu 72 hodín. Obrázok 13: Rýchlosť prežitia buniek HT22 po inkubácii s 1 um, 2 um, 5 um, 10 um, 20 um, 50 um, 100 um a 200 um 2SH, 4SH, 8SH a 12SH po dobu 72 h (n> = 3). Po 72 hodinách inkubácie buniek HT22 s lipofilnými látkami 2SH, 4SH, 8SH a 12SH sa zistila diferencovaná toxicita. S rastúcou koncentráciou sa zvyšuje toxicita všetkých látok. Toxický účinok je najvýraznejší pri 12SH, potom 8SH, 4SH a 2SH. Toxicita teda koreluje s dĺžkou alkylového reťazca a koncentráciou 62
Výsledky, koncentrácia neovplyvnila toxický účinok. Iba CAM vykázal toxicitu závislú od nízkej koncentrácie po 72 hodinách. Obrázok 15: Prežitie buniek IMR90 buniek (PD 28.1) po 72 hodinách inkubácie s 1 um, 2 um, 5 um, 10 um, 20 um, 50 um, 100 um a 200 um 2SH, 4SH a 8SH (n> = 3 ). Po 72 hodinách pôsobenia na bunky IMR90 čoraz lipofilnejšími látkami 2SH, 4SH a 8SH došlo tiež k nízkej toxicite (obrázok 15). Žiadna z troch použitých látok nevykazovala žiadne zjavné účinky závislé od dávky. Obrázok 16: Rýchlosť prežitia buniek IMR90 (PD 28,1) po 72 hodinách inkubácie s 1 um, 2 um, 5 um, 10 um, 20 um, 50 um, 100 um a 200 um 10SH, 12SH, 14SH (n> = 3 ). Miera prežitia buniek IMR90 ošetrených 10SH, 12SH a 14SH po dobu 72 hodín sa zvýšila o 64