Experimentálny prístup k skúmaniu signalizácie leptínu v krčných telách a jeho účinkov na kontrolu
Zhrnutie
Naša štúdia sa zameriava na účinky signalizácie leptínu v karotickom tele (CB) na hypoxickú ventilačnú odpoveď (HVR). Vykonali sme experimenty „straty funkcie“ na meranie účinku leptínu na HVR po denervácii CB a experimenty „zisku funkcie“ na meranie HVR po nadmernej expresii leptínového receptora v CB.
Abstrakt
Hormón vyrobený z adipocytov, leptín, je silný stimulant dychu, ktorý môže hrať dôležitú úlohu pri obrane dýchacích funkcií pri obezite. Karotické telieska (CB), kľúčový orgán periférnej hypoxickej citlivosti, exprimujú dlhú funkčnú izoformu leptínového receptora (LepRb), ale úloha leptínovej signalizácie pri kontrole dýchania nie je úplne objasnená. Skúmali sme odpoveď na hypoxickú ventiláciu (HVR) (1) u myší C57BL/6J pred a po základnej infúzii leptínu a po denervácii CB; (2) u myší s deficitom LepR b s nadmernou hmotnosťou db/db na začiatku a po nadmernej expresii LepR b v CB. U myší C57BL/6J boli leptínom zvýšená HVR a účinok leptínu na HVR eliminované CB denerváciou. U db/db myší expresia lepRb v CB predĺžila HVR. Preto sme dospeli k záveru, že leptín v CB pracuje na zvýšení odpovede na hypoxiu.
Úvod
Adipocyt produkuje hormón leptín, ktorý pôsobí v hypotalame na potlačenie príjmu potravy a zvýšenie rýchlosti metabolizmu. Štúdie v našom laboratóriu 1, 2 a ďalšími výskumníkmi 3, 4 preukázali, že leptín zvyšuje hyperkapnickú respiračnú odpoveď (HVR), hypoventilácia obezity v leptíne predchádza nedostatku obezity. Avšak väčšina obéznych jedincov má vysoké plazmatické hladiny leptínu a vykazuje odolnosť voči metabolickým a respiračným účinkom hormónu 5, 6, 7, 8. Rezistencia na leptín je multifaktoriálna, ale dôležitú úlohu zohráva obmedzená permeabilita hematoencefalickej bariéry (BBB) pre leptín. Navrhujeme, aby leptín pod BBB pôsobil v kľúčovom orgáne periférnej hypoxickej citlivosti, v karotickom tele (CB), na obranu dýchania u obéznych osôb. CB exprimujú dlhú funkčnú izoformu leptínového receptora LepRb, ale úloha CB pri priedušnejších účinkoch leptínu nebola dostatočne objasnená 9, 10 .
Cieľom našej metódy bolo zistiť vplyv leptínovej signalizácie v CB na HVR. Našim odôvodnením bolo (a) vykonať špekulačné výnimky z funkčných experimentov na myšiach s intaktnými karotickými telieskami a denervovanými karotickými telieskami, po ktorých nasledovali merania HVR; b) Posilnenie funkčných experimentov na db/db myšiach bez LepR b, v ktorých sme merali HVR na začiatku a po expresii LepR b výlučne v CB. Výhodou našich techník bolo, že sme všetky naše experimenty uskutočňovali na nespútaných, neestetizovaných myšiach počas spánku a bdenia. Predošlí vedci uskutočňovali experimenty v anestézii 9 alebo nemerali účinky leptínu počas spánku 10. Naša štúdia navyše ako prvá využíva jedinečný prístup zisk-funkcie so selektívnou expresiou LepR-b v CB opísanou vyššie.
V širokom kontexte možno náš prístup zovšeobecniť na iné receptory exprimované v CB a na ich úlohu v hypoxickej citlivosti. Vyšetrovatelia môžu injikovať ligand na požadovaný receptor a merať HVR na začiatku a po denervácii CB. Ako doplnkový prístup môže byť záujmový receptor nadmerne exprimovaný v meraniach CB a merania HVR môžu byť vykonávané pred a po nadmernej expresii našou technológiou opísanou v tomto rukopise.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
Všetky experimentálne protokoly boli schválené Výborom pre ústavnú starostlivosť a použitie zvierat (MO18M211).
POZNÁMKA: Na štúdium účinku leptínu na dýchanie sme infúziu leptínu podávali subkutánne chudým myšiam C57BL/6J pomocou osmotickej pumpy, aby sme zvýšili cirkulujúce hladiny leptínu na hladiny pozorované u myší s nadváhou.
- Príprava osmotickej pumpy
- Prázdne čerpadlo odvážte, aby ste skontrolovali čistú hmotnosť naplneného roztoku.
- Pridajte leptín (5 mg/ml) do osmotickej pumpy (1 l/h po dobu 3 dní). Naplňte pumpu malou injekčnou striekačkou (1 ml). Po naplnení zatvorte čerpadlo pomocou dodanej 27-stopej plniacej trubice naklonenej na tupo.
POZNÁMKA: Injekčná striekačka a pripojená hadička by nemali obsahovať vzduchové bubliny. - Po naplnení čerpadlo znovu zvážte, aby ste skontrolovali čistú hmotnosť roztoku.
- Vložte leptínovú pumpu subkutánne do medzilopatkovej oblasti.
POZNÁMKA: Ak chcete infúziu začať okamžite, inkubujte naplnenú pumpu pri teplote 37 ° C pri teplote 37 ° C najmenej 4 až 6 hodín (najlepšie cez noc).
2. Hypoxická ventilačná odpoveď (HVR)
3. Denervácia tela karotídy alebo disekcia karotického sínusového nervu (CSND)
POZNÁMKA: Vykonali sme kombinovanú chirurgickú a chemickú denerváciu s odstupom jedného týždňa, pretože samotná chirurgická denervácia nezruší hypoxický chemoreflex.
4. Expresia LepRb v CB adenovírusovým vektorom (Ad-LepR b) vs kontrolou (Ad-LacZ)
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Kontinuálna infúzia leptínu významne zvýšila HVR u chudých myší C57BL/6J z 0,23 na 0,31 ml/min/g/FiO2 (P obrázok 2)) 11. CSND zrušil leptínom indukované zvýšenie HVR (obrázok 2), zatiaľ čo v skupine s fingovanou chirurgiou po infúzii leptínu neboli pozorované žiadne zmierňujúce účinky CSND na HVR.
Expresia LepRb v CB obéznych db/db myší s nedostatkom LepRb indukovala významné zvýšenie HVR z 0,05 na 0,06 ml/min/g/SpO2 (obrázok 3)). HVR sa nezmenila u zvierat transfekovaných do CB s kontrolným Ad-LacZ.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
Cieľom našej štúdie bolo preskúmať dýchateľnejšie účinky leptínovej signalizácie v CB. Bolo vyvinutých niekoľko protokolov na mechanické hodnotenie úlohy leptínu. Najskôr sa špecifický príspevok CB k IHL analyzoval opatrnou kvantifikáciou IHL počas prvých 2 minút hypoxickej expozície. Po druhé, význam CB pre leptínom sprostredkovanú reguláciu dýchania bol skúmaný pomocou dvoch komplementárnych prístupov. U štíhlych myší divokého typu s nízkymi hladinami leptínu sa HVR merala na začiatku a po kontinuálnej infúzii leptínu; experiment sa opakoval po denervácii CB. U myší db/db s deficitom LepR b sa merala HVR v CB na začiatku a po expresii LepR b.
CSND u myší je technicky náročná z dôvodu malých rozmerov zvierat a ich CB. Vyvinuli sme trvalo úspešný prístup s mierou prežitia takmer 100% v prísnom súlade s našim protokolom. Kontrolované podmienky v našom protokole zahŕňajú termo-neutrálne prostredie, starostlivo kontrolovanú anestéziu a štandardné sterilné mikrochirurgické techniky s vizualizáciou glossofaryngeálneho nervu ako bdelého pooperačného manažmentu s kontrolou bolesti. Naše skúsenosti ukazujú, že samotná chirurgická denervácia nezruší hypoxický chemoreflex. Po druhom kroku, chemickej denervácii, nasleduje starostlivé pooperačné zvládnutie, aby sa zlepšilo prežitie.
Našou najinovatívnejšou technikou je selektívna nadmerná expresia génov v oblasti CB. Tento prístup ešte nebol implementovaný, pretože CB majú iba malú veľkosť a nie sú exprimované žiadne špecifické stimulátory, ktoré umožňujú expresiu požadovaného génu pre konkrétny bunkový typ. V skutočnosti sú CB bunky typu I veľmi podobné sympatickým neurónom alebo bunkám drene nadobličiek, zatiaľ čo bunky typu II sú podobné astrocytom 20, 21. Využili sme výhody myší db/db bez génu LepR b, našu schopnosť aplikovať adenovírusovú suspenziu takmer výlučne na oblasť CB a vlastnosti matrice Matrigel, ktorá rýchlo tuhne pri teplote 37 ° C. Náš nový prístup bude možné v budúcnosti použiť na vyšetrenie úlohy ktoréhokoľvek génu, ktorý exprimuje špecifické pre tyrozínhydroxylázu (bunky typu I) alebo špecifické pre GFAP (bunky typu II) v CB s myšami celého tela sa stáva.
Naše protokoly majú niekoľko obmedzení. Najprv sme na stanovenie MHP použili 3% CO2 a otázkou zostáva, či je možné podiel MHP skutočne pripísať hyperkapnickej reakcii. Na riešenie tohto obmedzenia môžu vedci súčasne merať reakcie na 3% offset CO2 v hyperoxickom plyne, čo by CB vyplo. Po druhé, HVR nemožno úplne vylúčiť z CSND 22. Tento jav možno pripísať neuroplasticite, ktorá je zvlášť výrazná u myší. Preto je dôležité študovať HVR čo najskôr po CSND a vždy používať kontrolu fingovanej operácie. Po tretie, náš prístup k expresii génov CB nemal bunkový typ a orgánovú špecifickosť. Proti tomuto obmedzeniu môžu pomôcť molekulárne techniky s budúcim použitím selektívnejších promótorov.
Na záver možno povedať, že napriek vyššie opísaným obmedzeniam môžu naše protokoly skúmať úlohu určitých génov CB vo fyziologických reakciách na hypoxiu.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Zverejnenie
Autori nemajú protichodné záujmy ani zjavenia.