Extrahepatálna regulácia hepcidínu závislá od železa - PDF na stiahnutie zadarmo
1 Centrum internej medicíny Univerzitnej nemocnice Ulm Klinika interného lekárstva I Lekársky riaditeľ: Prof. Dr. med. Thomas Seufferlein Regulácia extrahepatálneho hepcidínu závislá od železa Dizertačná práca Získanie doktorandského titulu v odbore zubné lekárstvo na Lekárskej fakulte Univerzity v Ulme, ktorý predniesla Clara Ruth Frieda Brenig z Mníchova 2013
2 poverený dekan: prof. Dr. Thomas Wirth, prvý reportér: PD Dr. Pavel Strnad 2. Spravodajca: Prof. Dr. Deň propagácie Larsa Bullingera:
4 Obsah Obsah Zoznam čísel Zoznam tabuliek Zoznam skratiek III V VI 1 Úvod Rovnováha železa Expresia a štruktúra hepcidínu Mechanizmy pôsobenia hepcidínu Regulácia hepatického hepcidínu Hepcidín v extrahepatálnych orgánoch Cieľ výskumnej práce Materiál a metódy Materiál Chemikálie Reakčné prístupy a tlmivé roztoky Súpravy Prístroje Metódy Chov zvierat Experimentálne usporiadanie a testovanie zvierat Izolácia RNA z tkaniva cdna syntéza prvého vlákna Kvantitatívne PCR v reálnom čase Stanovenie železa v tkanive Extrakcia proteínu z tkaniva Stanovenie proteínu Western blot Histológia a farbenie Stanovenie sérového feritínu a sérového železa Štatistické hodnotenie I
5 Obsah 3 Výsledky Koncentrácie železa a sérového feritínu po diétach s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa Účinok diéty s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa na pečeň Koncentrácia železa v pečeni Pečeňová expresia v pečeni Účinok diéty s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa na extrahepatálne orgány Účinok diéty s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa na slezinu Diéty s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa v žalúdku Vplyv diéty s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa na pankreas Vplyv diéty s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa na obličky Vplyv diéty s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa na dvanástnik Vplyv diéty s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa na srdce Diskusia Systémové parametre železa v závislosti od obsahu železa v podávanej strave Lokálna koncentrácia železa v extrahepatálnych orgánoch v závislosti od obsahu železa v podávanej strave Hepcidínové prejavy extrahepatálnych orgánov v závislosti od podávanej stravy Abstrakt 53 Ref Register 54 Poďakovanie 63 Životopis 64 II
8 Zoznam tabuliek Zoznam tabuliek Tab. 1 Sekvencie primérov pre analýzu RT-PCR Tab. 2 Štandardný roztok železa Tab. 3 Schéma pipetovania na prípravu gélu tricín-SDS-polyakrylamid 22 Tab. 4 Primárne protilátky Tab. 5 Sekundárne protilátky V
9 Zoznam skratiek Zoznam skratiek µ Micro ALK2/APS AS BMP (R) BPS BSA cdna dest DFO DMT DNA dntp DTT ECL GP 80/H 2 O HAMP Hepc1/HFE HJV IFN-γ IL-6 (R) M n NaCl aktivínový receptor podobný Kináza2/3 Peroxodisíran amónny Aminokyselina Kosť Morfogenetický proteín (receptor) Kyselina batofénantrolíndisulfónová Disodná soľ Tele sérum Albumín Doplnková DNA Destilovaný desferroxamín Dvojmocný nosič kovov1 Deoxyribonukleová kyselina Deoxy-nukleotid trifosfát Ditiotreitol-antylín 2 Receptor) Molárny nano chlorid sodný VI
10 Zoznam skratiek p PCR psmad qrt RNA rpm SDS SMAD STAT TBS TEMED Tf (R) TGF Tris V Pico polymerázová reťazová reakcia Fosforylovaná SMAD Kvantitatívne množstvo ribonukleových kyselín v reálnom čase za minútu Dodecylsulfát sodný Spinálna svalová atrofia a matkyagainstekapentapalín-signalesterázy a, N, N, N-tetrametyletyléndiamín 1,2-bis (dimetylamino) -etán transferín (receptor) Transformujúci rastový faktor Tris- (hydroxymetyl) -aminometán Volt VII
19 1 Úvod Orgány sú však väčšinou nepreskúmané. Rôzne štúdie zatiaľ preukázali, že rôzne faktory ako napr Preťaženie železom, zápal alebo hypoxia môžu ovplyvniť lokálnu expresiu hepcidínu v ne-pečeňových orgánoch, ale mechanizmus zvyčajne zostáva nevysvetlený. S cieľom zlepšiť porozumenie regulácii extrahepatálnej hepcidínu súčasná výskumná práca analyzovala vplyv preťaženia alebo nedostatku železa na rovnováhu železa a expresiu hepcidínu v rôznych tkanivách. Na tento účel sa ako modelový systém použili myši divého typu a kŕmili sa rôznymi diétami železa. Vplyv týchto diét na expresiu hepcidínu sa potom skúmal na hladinách RNA a proteínov. Ďalej sa merala koncentrácia železa v tkanivách. 9
20 2 Materiál a metódy 2 Materiál a metódy Všetky chemikálie, reagencie, súpravy, materiály a zariadenia použité pri tejto práci sú uvedené v nasledujúcich zoznamoch. 2.1 Materiál Chemikálie Akrylamid APS (persíran amónny) Kyselina L-askorbová β-merkaptoetanol disodná soľ kyseliny bathofenantrolín disulfónovej (BPS) Bisakrylamid Hovädzí sérový albumín (BSA) Bradfordovo činidlo Bromfenolová modrá Coomassie modrá deoxynukleotid trifosfát (dntp) trifosfát Ditiotreitol (DTT) ECL Sigma Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Bio Rad, Laboratories GmbH, Mníchov Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Sigma Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg BIO-RAD Laboratories GmbH, Mníchov Sigma Aldrich Chemie GmbH, Mníchov BIO-RAD Laboratories GmbH, Mníchov PeqLab, Erlangen MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Veľká Británia 10
21 2 Materiál a metódy Železo III Nonahydrát Dusičnan Uhličitan železitý Vývojka Eosín Etanol Fixačný roztok Formaldehyd Glycerín Glycín Hematoxylín Isopropanol Draslík Hexakyanoferát Chlorid II Jadrová Rýchla červená Metanol Novex ostrý Proteín Oligo (dT) 20-Primer Protein Inhibitor Koktejl-tablety RNeasy Master Mix SuperScriptIII reverzná transkriptáza Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Tentenal AG & Co KG, Norderstedt Merck KGaA, Darmstadt Sigma Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Tetenal AG & Co KG, Norderstedt Sigma Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Merck KGaA, Darmstadt Sigma Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Merck, Darmstadt Vector Laboratories, Burlingame, USA Sigma Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Dako Deutschland GmbH, Hamburg Invitrogen, Darmstadt Roche, Mannheim Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Invitrogen GmbH, Darmstadt 11
22 2 Materiál a metódy Kyselina chlorovodíková TEMED (N, N, N, N-tetrametyletyléndiamín) Tris- (hydroxymetyl) aminometán Tween20 xylén Monohydrát kyseliny citrónovej VWR International GmbH, Darmstadt Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Sigma Aldrich Chemie GmbH, Mníchov Sigma Aldrich Chemie GmbH, Mníchov VWR, Ulm Merck KGaA, Darmstadt 12
23 2 Materiál a metódy Reakčné šarže a tlmivé roztoky Kyselina askorbová Anódový tlmivý roztok Blotovací tlmivý roztok BPS Coomassie Blue solution DNase mix Extrakčný tlmivý roztok Pracovný roztok na farbenie železom Tlmivý roztok gélu (5x) 0,088g kyselina askorbová 5ml H 2 O 24,22 g Tris ad 1L H 2 O 3,03g Tris 11,26 g glycínu, 100 ml metanolu a 1 objem. H20 O 8,3 14,76 mg BPS 5 ml H20 400 ml metanolu 100 ml kyseliny etánovej 0,4 g Coomassie blue 250G a 1L dist. H 2 O 70 ul RDD 10 ul DNázy/vzorka 10 mM Tris 0,5% Triton X-100 ph 7,5 100 ml 2% hexakyanoferát draselný II 100 ml 1% HCl 1 M Tris 10% SDS 50% glycerín 25% β merkaptoetanol brómfenolová modrá 375 ul dist. H 2 O ph 6,8 13
24 2 Materiál a metódy Stohovací gélový tlmivý roztok Katódový tlmivý roztok Štandardný roztok na stanovenie železa Separačný gélový tlmivý roztok T40/C3 T40/C6 Tris-pufrovaný soľný roztok (TBS) Tris-pufrovaný soľný roztok s pufrom Tween (TBST) RLT + β ME master mix pre syntézu cdna I 60, 5 g Tris do 1 L dist. H 2 O ph 6,8 12,11 g Tris 17,92 g Tricín 10 ml SDS ad 1L H20 0,003607 g Dusičnan železitý III Nehydrát 1 ml H20 1811,71 g Tris ad 1L dist. H 2 O ph 8,8 7,76 g akrylamidu 0,24 g bisakrylamidu a 20 ml VE-H 2 O 18,8 g akrylamidu 1,2 g bisakrylamidu a 50 ml VE H 2 O 8,76 g NaCl 1,21 g Tris ad 1L dist. H20 O 7.5 7.5 1 L TBS 1 ml Tween20 10 ul 1% β merkaptoetanol 1 ml RLT (súčasť súpravy RNeasy Mini Kit) 1 ul Oligo (dT) 20-primeru (0,2 μg/ul) RNA (2 μg) 1 ul dntp-zmesi (každý 10 mM ) ad 14 ul vody bez RNázy 14
25 2 Materiál a metódy Master-Mix pre syntézu cdna II Master-Mix pre RT-PCR Primermix kyselina citrónová 4 μl tlmivý roztok prvého vlákna 1 μl 0,1 M DTT 1 μl SuperScriptIII RT (200 U/μl) 5 μl SYBR-Mix 3 μl H 2 O dest . 0,03 ul predného primeru (100 pmol) 0,03 ul zadného primeru (100 pmol) a 1 ul H20 dist. 1,05 g monohydrátu kyseliny citrónovej 50 ml sady H20 O RNeasy Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden obsahuje: First-Strand-Buffer RDD (RNase-free buffer) RNeasy lysis buffer RLT Rnase-free DNase RW1 RPE devices 7500 Fast Real-Time PCR System with Softvér: Sekvenčná detekcia, verzia 1.5 Softvér na analýzu dát KC4 Analytické váhy Applied Biosystems, Darmstadt BioTek, Bad Friedrichshall Sartorius AG, Göttingen 15
37 výsledkov kontrolnej diéty sa ťažko znížilo (86,9 ± 24 ug/g v skupine chudobnej na železo, 105,2 ± 22,6 ug/g v kontrolnej skupine. Pozri obrázok 6). Koncentrácia železa v pečeňovom tkanive skupiny bohatej na železo bola 5-krát vyššia ako koncentrácia v kontrolnej strave (589,4 ± 243 ug/g v skupine bohatej na železo). Obrázok 5: Histologické vyšetrenie pečene myší po štandardnej strave s nízkym obsahom železa a bohatom na železo. Tkanivo pečene, ktoré bolo zafarbené sfarbením Berlínskou modrou, ukazuje v (A) tkanive myší, ktoré boli kŕmené nízkym obsahom železa, v (B) štandardným krmivom a v (C) sa kŕmili jedlom bohatým na železo. U myší, ktoré boli kŕmené stravou bohatou na železo, je možné pozorovať významnú periportálnu akumuláciu železa (šípka). Zväčšenie: 20-násobná koncentrácia železa (µg/g) p = 0, EA ST ER Obrázok 6: Koncentrácia železa v pečeňovom tkanive myší po nízko železnej, štandardnej a na železo bohatej strave Koncentrácia železa v pečeni myší po 5 týždňoch nízko železného (EA), štandardná ( ST) a 4-týždňová strava bohatá na železo (ER). Sú uvedené priemerné hodnoty najmenej 5 myší na skupinu Expresia hepatálneho hepcidínu Expresia hepcidínu 1 a hepcidínu 2 u myší kŕmených chudobou na železo bola významne znížená v porovnaní s kontrolnou stravou (hepcidín1: p = 0,001; hecidín2: 27).
40 3 Výsledky 400 Koncentrácia železa (µg/g) p = 0, p = 0,03 0 EA ST ER Obrázok 9: Koncentrácia železa v tkanive sleziny u myší po nízkej koncentrácii železa a štandardnej strave bohatej na železo Koncentrácia železa v slezine myší po 5 týždňoch nízkeho množstva železa (EA), štandardná (ST) a 4-týždňová strava bohatá na železo (ER). Sú uvedené priemerné hodnoty najmenej 5 myší na skupinu. Expresia AB 6 5 Hepcidín 1 vzhľadom na ß-aktín p = 0,03 p = 0,05 Expresia hepcidínu 2 vzhľadom na ß-aktín EA ST ER 0 EA ST ER Obrázok 10: Expresia hepcidínu mrna v slezine u myší s nízkou hladinou železa „Štandardná a na železo bohatá strava (A) Hepcidín1 a (B) expresia hepcidínu2 v porovnaní s expresiou β-aktínu v slezine u myší po diéte chudobnej na železo (EA), štandardnej strave (ST) a strave bohatej na železo (ER) kvantifikovanej pomocou RT -PCR. Výsledky sa uvádzajú ako priemer najmenej 5 myší na skupinu ± štandardná odchýlka. Hodnoty sú relatívne hodnoty, ktoré boli normalizované vzhľadom na kontrolu (= 1). 30
42 3 Výsledky A B C Obrázok 12: Histologické vyšetrenie žalúdočného tkaniva myší s nízkym obsahom železa, štandardnou stravou a stravou bohatou na železo Berlínskym modrom zafarbením korpusu u myší (A) po kŕmení nízkym obsahom železa, (B) kontrolná skupina, (C) skupina bohatá na železo. Príklady akumulácie železa v hlavných bunkách kontrolnej stravy a stravy bohatej na železo sú označené šípkou. Zväčšenie: 20-krát. vykonaná analýza tern blot a kvantitatívna RT-PCR. V analýze proteínov vykazovali protilátky proti STAT3 a aktívnej forme STAT3, pstat3, pás pri 70 kDa (pozri obrázok 15). Avšak vzhľadom na konštantnú intenzitu pásma vyšetrovanie neodhalilo žiadne dôkazy o zvýšenej produkcii STAT3. Expresia IL-6 sa navyše merala pomocou kvantitatívnej RT-PCR. Z dôvodu extrémne nízkych hladín expresie sa ukázalo, že nedošlo k žiadnemu zápalu (2,3 ± 1,6 v skupine s chudobou na železo, 1 ± 0,5 v kontrolnej skupine, 2,4 v skupine s bohatým obsahom železa, pozri obrázok 16). 32
43 3 Výsledky 600 koncentrácia železa (µg/g) p = 0,007 0 EA ST ER Obrázok 13: Zmena koncentrácie železa v korpuse myší po nízkej, štandardnej a bohatej strave železa Koncentrácia železa v korpuse myší po 5 týždňoch nízkej hladiny železa (EA), štandardná - (ST) a 4-týždňová strava bohatá na železo (ER). Myši, ktorým sa podával štandardný žrádlo, slúžili ako kontroly. Sú uvedené priemerné hodnoty najmenej 5 myší na skupinu. Expresia AB 20 1.5 Hepcidín1 vzhľadom na ß-aktín p = 0,03 Expresia hepcidínu2 vzhľadom na ß-aktín 1 0,5 p = 0,04 0 EA ST ER 0 EA ST ER Obrázok 14: mrna-expresia im Korpus myší po štandardnej strave s nízkym obsahom železa a diéte bohatej na železo (A) Hepcidín1 a (B) Expresia hepcidínu2 v porovnaní s expresiou β-aktínu v korpuse u myší po strave s nízkym obsahom železa (EA), štandardnej strave (ST) a strave s vysokým obsahom železa (ER) kvantifikované pomocou RT-PCR. Výsledky sa uvádzajú ako priemer ± štandardná odchýlka. Hodnoty sú relatívne hodnoty, ktoré boli normalizované vzhľadom na kontrolu (= 1). 33
44 3 Výsledky nízky obsah železa štandardný vysoký obsah železa v pečeni PosKont pstat3 STAT3 ß-tubulín Obrázok 15: Proteínová expresia STAT3/pSTAT3 u myší po nízkej hladine železa, štandardnej strave a strave bohatej na železo Western blot analýza žalúdočného tkaniva myší po strave s nízkym obsahom železa, štandardnej a bohatej na železo. Protilátky: pstat3 (fosfosignálne transduktory a aktivátor transkripčného proteínu), STAT3 (signálne transduktory a aktivátor transkripčného proteínu). Pečeň PosKont zodpovedá pozitívnej kontrole pečene. Ako kontrola nanášania sa použil p-tubulín. 5 Expresia IL-6 vzhľadom na ß-aktín p = 0,01 0 EA ST ER Obrázok 16: expresia mrna v korpuse myší po expresii interleukínu-6 (IL-6) s nízkym obsahom železa, štandardnej a bohatej na železo v porovnaní s β-aktínom Expresia v korpuse u myší po diéte s nízkym obsahom železa (EA), štandardnej strave (ST) a strave bohatej na železo (ER) kvantifikovaná pomocou RT-PCR. Výsledky sa uvádzajú ako priemer najmenej 5 myší na skupinu ± štandardná odchýlka. Hodnoty sú relatívne hodnoty, ktoré boli normalizované vzhľadom na kontrolu (= 1). 34
46 3 Výsledky 25 Koncentrácia železa [! G/g] EA ST ER Obrázok 18: Koncentrácia železa v pankrease myší po nízkotučnej, štandardnej a bohatej strave Koncentrácia železa v pankrease myší po 5 týždňoch nízkej hladiny železa (EA), štandardnej (ST) a 4-týždňová strava bohatá na železo (ER). Myši, ktoré dostali štandardné krmivo, slúžili ako kontroly. Sú uvedené priemerné hodnoty najmenej 5 myší na skupinu. Expresia AB 2 2 Hepcidín1 vzhľadom na ß-aktín 1 Hepcidín2 expresia vzhľadom na ß-aktín 1 p = 0,03 0 EA ST ER 0 EA ST ER Obrázok 19: Expresia mrny v pankrease u myší chudobných na železo, štandardných a bohatých na železo Diéta (A) Hepcidín 1 a (B) Expresia hepcidínu 2 vo vzťahu k expresii p-aktínu v pankrease u myší po diéte chudobnej na železo (EA), štandardnej strave (ST) a strave bohatej na železo (ER) kvantifikovanej pomocou RT-PCR. Výsledky sa uvádzajú ako priemer najmenej 5 myší na skupinu ± štandardná odchýlka. Hodnoty sú relatívne hodnoty, ktoré boli normalizované vzhľadom na kontrolu (= 1). 36
48 3 Výsledky 300 Koncentrácia železa [! G/g] EA ST ER Obrázok 21: Koncentrácia železa v obličkách myší po nízkej koncentrácii železa a štandardnej strave bohatej na železo Koncentrácia železa v obličkách myší po 5 týždňoch nízkej hladiny železa (EA), štandardná (ST ) a 4-týždňová strava bohatá na železo (ER). Myši, ktorým sa podával štandardný žrádlo, slúžili ako kontroly. Sú uvedené priemerné hodnoty najmenej 5 myší na skupinu. Expresia AB Hepcidín1 vo vzťahu k ß-aktínu Hepcidín2 expresia vo vzťahu k ß-aktínu EA ST ER 0 EA ST ER Obrázok 22: Expresie hepcidínu mrna v obličkách u myší po štandardnej strave bohatej na železo (A) Hepcidín 1 a (B ) Expresia hepcidínu2 vo vzťahu k expresii p-aktínu v obličkách u myší po diéte chudobnej na železo (EA), štandardnej strave (ST) a strave bohatej na železo (ER) kvantifikovanej pomocou RT-PCR. Výsledky sa uvádzajú ako priemer najmenej 5 myší na skupinu ± štandardná odchýlka. Hodnoty sú relatívne hodnoty, ktoré boli normalizované vzhľadom na kontrolu (= 1). 38
50 3 Výsledky 400 Koncentrácia železa [! G/g] p = 0, EA ST ER Obrázok 24: Koncentrácia železa v dvanástniku u myší po štandardnej a na železo bohatej strave Koncentrácia železa v dvanástniku myší po 5 týždňoch nízkej hladiny železa (EA), štandard (ST) a 4-týždňová strava bohatá na železo (ER). Ako kontroly slúžili myši, ktorým sa podávalo štandardné krmivo. Sú uvedené priemerné hodnoty najmenej 5 myší na skupinu. Expresia AB 4 2 Hepcidín1 vzhľadom na ß-aktín Hepcidín2 expresia vzhľadom na ß-aktín 1 0 EA ST ER 0 EA ST ER Obrázok 25: Expresia hepcidínu mrna v dvanástniku u myší po štandardnej strave bohatej na železo (A) Expresia hepcidínu 1 a (B) Hepcidínu 2 v porovnaní s expresiou β-aktínu v dvanástniku u myší po diéte chudobnej na železo (EA), štandardnej strave (ST) a diéte bohatej na železo (ER) kvantifikovanej pomocou RT-PCR. Výsledky sa uvádzajú ako priemer najmenej 5 myší na skupinu ± štandardná odchýlka. Hodnoty sú relatívne hodnoty, ktoré boli normalizované vzhľadom na kontrolu (= 1). 40
51 3 Výsledky Vplyv diéty s nízkym obsahom železa a vysokým obsahom železa na srdce V srdci neboli zistené žiadne histologické zmeny alebo akumulácia železa (pozri obrázok 26). Koncentrácia železa v srdci zodpovedá 10% koncentrácie železa v pečeni. Zmeny medzi stravou s nízkym obsahom železa a kontrolnou stravou nie sú zrejmé, ale existuje tendencia zvyšovať koncentráciu v strave s vysokým obsahom železa (8,5 ± 12,0 µg/g v skupine s nízkym obsahom železa, 3,1 ± 5,7 µg/g v kontrolnej skupine, 25,7 ± 22,9 µg/g v skupine bohatej na železo, pozri obrázok 27). Okrem toho hladiny expresie hepcidínu v srdci taktiež nevykazovali žiadne zmeny (hepcidín1: 1,5 ± 0,8 v skupine so zníženým obsahom železa, 1 ± 0,7 v kontrolnej skupine, 2,5 ± 1,4 v skupine bohatej na železo; hepcidín2: 1,2 ± 0,3 v skupine chudobnej na železo, 1 ± 0,1 v kontrolnej skupine, 1,3 ± 0,3 v skupine bohatej na železo). Pozri obrázok 28. ABC Obrázok 26: Histologické vyšetrenie srdca myší po štandardnej strave bohatej na železo a strave bohatej na železo Berlínske modré sfarbenie v srdci myší po (A) nízkom obsahu železa, (B) štandardnom kŕmení a (C) bohatom na železo . Zväčšenie: 20-krát. 41