Genómové molekulárne genetické skúmanie variácií počtu kópií DNA (CNV) v

Z Inštitútu pre neuropatológiu Lekárskej fakulty Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Genómový molekulárny genetický výskum variácií počtu kópií DNA (CNV) v cholangiocelulárnych karcinómoch na získanie akademického titulu Doctor medicinae (Dr. med.) Prezentované na Lekárskej fakulte Charité Universitätsmedizin Berlin Alexander Arnold Ramenskoye dátum doktorátu: 09.09.2016

molekulárne

Obrázok 1-1 Klasifikácia subtypov cholangiokarcinómu na intrahepatálny a extrahepatálny (perihilárny a distálny) na základe anatomického umiestnenia podľa klasifikácie UICC. Modified from Blechacz et al, 2011 (10) 1.3 Epidemiológia cholangiokarcinómu Výskyt cholangiocelulárneho karcinómu, ktorý predstavuje 3% všetkých gastrointestinálnych nádorov, na celom svete stúpa (12, 13). Výskyt sa však v rôznych krajinách veľmi líši, v západnej Európe je jeho výskyt 1–2/100 000 a v juhovýchodnej Ázii až stokrát vyšší (14). Za tento nesúlad sú zodpovedné rôzne miestne rizikové faktory a genetické podmienky (15). V intra- aj extrahepatálnych cholangiokarcinómoch sú muži na celom svete postihnutí častejšie ako ženy, v pomere 1,5 (14). V obidvoch podtypoch je väčšina postihnutých starších ako 65 rokov, keď je stanovená diagnóza (16). Pacienti sa však nachádzajú v krajinách s vyšším výskytom (juhovýchodná Ázia) 7

Obrázok 1-2 Makroskopická klasifikácia intrahepatálnych cholangiokarcinómov podľa Japonskej študijnej skupiny pre rakovinu pečene (LCSGJ). Blechazc et al, 2011 (10) V prípade extrahepatálnych cholangiokarcinómov sa opäť rozlišuje medzi exofytickým a intraduktálnym rastovým modelom (42), pričom oba typy sú spojené s perineurálnou inváziou a postihnutím lymfatických uzlín (10). Pre histologickú klasifikáciu cholangiokarcinómov existuje okrem klasifikácie WHO aj aktuálne vydanie AJCC/UICC, ktoré popisuje adenokarcinómy ako najbežnejšiu formu, ako aj zriedkavejšie formy (adenokvamózne a skvamózne karcinómy, mucinózne bunky, bunky s tesniacim krúžkom, sarkomatózne, lymfoepitelové) 43, 44). Najbežnejšou formou cholangiocelulárneho karcinómu je stredne až dobre diferencovaný adenokarcinóm, ktorý sa vyznačuje žľazovou alebo rúrkovou štruktúrou. Kubické alebo stĺpcové anaplasticky zmenené epitelové bunky vykazujú eozinofilnú cytoplazmu so zaoblenými centrálnymi jadierkami. Heterogénne nádorové bunky sa často šíria pozdĺž stien žlčových ciest a nervových obalov (45). 11

Pre farmakologickú liečbu cholangiokarcinómu neexistovala do roku 2010 štandardizovaná chemoterapia z dôvodu nedostatočných údajov. Monoterapia gemcitabínom, ktorý sa často používa, priniesla iba neuspokojivé výsledky (98). Štúdiami NCRI ABC-01 a ABC-02 z Anglicka sa však zistila potenciálne trendová terapia pozostávajúca z gemcitabínu a cisplatiny pre neresekovateľné nádory systému žlčových ciest (99, 100). Výsledky týchto štúdií by mohla potvrdiť aj porovnateľná štúdia v Japonsku (101). Monoklonálne protilátky, ktoré špecificky zasahujú do molekulárnych procesov, sú tiež novými terapeutickými prístupmi (102). Ich súčasné východiská a najnovšie výsledky výskumu budú preskúmané ďalej v diskusnej časti. 19

3 Materiál a metódy 3.1 Pacienti a vzorky nádoru Pre jednotlivé vyšetrenia boli k dispozícii rôzne súbory vzoriek nádoru, ktoré sú podrobne uvedené. 1. Na analýzu pomocou sondy molekulárnej inverzie (MIP), imunohistochémie a fluorescenčnej hybridizácie in-situ (FISH) bolo použitých 24 vzoriek tumoru fixovaných formalínom v parafíne (FFPE) z archívu Ústavu pre patológiu, Charité - Universitätsmedizin Berlin. Všetky vzorky boli určené na MIP a imunohistochemické vyšetrenie a 20 vybraných vzoriek na FISH analýzu (tabuľka 3-1). Tabuľka 3-1 Populácia nádorov FFPE. 21. deň

2. Na účely vyšetrenia pomocou RT-PCR bolo z archívu Kliniky pre všeobecnú, viscerálnu a transplantačnú chirurgiu, Charité - Universitätsmedizin Berlin (30) kryokonzervované vzorky nádoru, ktoré boli po chirurgickom odstránení šokovo zmrazené v tekutom dusíku a skladované pri -80 ° C. Tabuľka 3-2). Tento súbor zahŕňa iba intrahepatálne cholangiokarcinómy. Tabuľka 3-2 Populácia kryokonzervovaných nádorov. 22

Vďaka modernej technológii multiplexu môže procesom prejsť viac ako 20 000 MIP v jednom prístupe a je tak možné ich analyzovať. Obrázok 3-2 Reakčná sekvencia prístupu MIP: (1) Väzba MIP na genómovú DNA (2) vyplnenie medzery polymerizáciou (3) ligácia homologických koncov MIP (4) exonukleáza odstráni nezreagované vzorky (5) uvoľnenie vzorky (6) ) Amplifikácia MIP pomocou PCR. Modifikované od Hardenbol a kol., 2003 (105) 26

Obrázok 3-3 Zhrnutie pracovného toku MIP. Modifikované podľa Hardenbol a kol., 2003 (105) Materiál a roztoky: Na uskutočnenie MIP vyšetrenia bolo 75 ng predtým extrahovanej genómovej nádorovej DNA prenesených do vodného roztoku. Prevedenie: Hybridizácia na poli OncoScan TM FFPE Express 2.0. Metóda molekulárnej inverzie sondy bola uskutočnená spoločnosťou Affymetrix (Santa Clara, USA) 3.5 Analýza údajov o počte kópií pomocou softvéru Nexus Copy Number Každá vzorka poľa MIP definuje lokalizáciu pozdĺž genómu, ktorá je určená intenzitou fluorescencie MIP bude. Transformácia intenzity signálu na zmeny počtu kópií sa nazýva segmentácia. Algoritmus SNP-FASST2, ktorý používa softvér Nexus, dáva do súvislosti intenzitu poľa v experimente s vnútornou kontrolou a transformuje ju pomocou logaritmu na základňu 2 (log2). V tomto prípade sú ako kontroly zoskupené iba nenádorové vzorky, ktoré potom slúžia ako referenčný signál, s ktorým sa každá vzorka nádoru porovnáva v postupe krok za krokom. Podľa toho vedie na danom mieste k odstráneniu SNP 27

pri nižšej intenzite signálu v porovnaní s referenciou, zatiaľ čo zosilnenie vedie k zvýšeniu signálu (obrázok 3-4). Obrázok 3-4 Schematické znázornenie priradenia intenzity signálu MIP k miestu pozdĺž chromozómu. Ručná kópia čísla Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Pre každú vzorku sú tieto hodnoty log2 zobrazené na osi x ako umiestnenie vzorky a na osi y ako hodnota logaritmického pomeru (obrázok 3-5). Obrázok 3-5 Príklad výsledkov experimentu a jeho znázornenie ako grafu pozdĺž genómu. Ručné kopírovanie čísla zariadenia Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) 28

Obrázok 3-6 Schematické znázornenie frekvencie alely B. Manuálna kópia čísla Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Tieto informácie o stave počtu kópií a pomere alely umožňujú softvéru vyvolať signály intenzity. Nasledujúca tabuľka 3-3 vysvetľuje, ako sa majú signály interpretovať. V prípade výhry jedného alebo viacerých kópií človek očakáva, že vo frekvenčnom diagrame alely uvidí alelickú nerovnováhu. Zisk môže byť zriedka taký silný, že takmer vytesní prítomnosť druhej alely, takže sa zobrazí obraz LOH. Strata kópie alely sa prejaví ako LOH, zatiaľ čo homozygotná strata sa prejaví ako celková strata alel. Kombinácia stavu nezmeneného počtu kópií a LOH v alelovom frekvenčnom diagrame naznačuje kópiu neutrálneho LOH. Tento proces, tiež známy ako uniparental disomy (UPD), nastáva, keď obidve alely odovzdá jeden rodič. 30

Tabuľka 3-3 Výsledky, ktoré možno očakávať pri kombinácii stavu počtu kópií a frekvencie alely B. Manuál kópie čísla Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Implementácia: Surové údaje sa analyzovali pomocou softvéru Nexus 6 Copy Number (Biodiscovery, El Segundo, CA) s vytvorením NCBI 36,1 ľudského genómu. K tomu bol zvolený segmentačný algoritmus SNP-FASST2. 3.6 Polymerázová reťazová reakcia (PCR) In vitro technika PCR umožňuje cielenú duplikáciu sekvencií DNA, ktoré sú ohraničené známymi segmentmi DNA. Plocha DNA, ktorá sa má replikovať, je ohraničená umelo vyrobenými primérmi, ktoré slúžia ako štartovacia pomôcka. Priméry sú krátke jednovláknové molekuly DNA, ktoré sú komplementárne s koncami definovanej sekvencie templátu DNA. Po počiatočnej denaturácii dvojvláknovej DNA do dvoch jednovláknových reťazcov a následnom anelovaní primérom sa DNA polymeráza rozšíri za vopred určených reakčných podmienok a za prítomnosti 31

IDH-2 dopredu: 5 -AGAATTTTAGGACCCCCCCGTCTG-3 IDH-2 naopak: 5 -AAAACCCCACTTCTGGTAAA-3 3.7 Agarózová gélová elektroforéza Výsledný produkt PCR sa deteguje separáciou fragmentov DNA pomocou gélovej elektroforézy. Aplikácia elektrického poľa na gél spôsobuje, že segmenty DNA migrujú k anóde kvôli svojim negatívne nabitým fosfátovým zvyškom. Po zafarbení pásov DNA etídiumbromidom, fluorescenčným farbivom, ktoré sa interkaluje s DNA, je možné jednotlivým pásom DNA priradiť určitú veľkosť pomocou štandardu. Materiál a roztoky: 2% agarózový gél (SERVA, Heidelberg, Nemecko) so 100 ul etídiumbromidu na 100 ml gélového roztoku 50 x TAE pufor (AppliChem, Darmstadt, Nemecko). Implementácia: Produkty PCR sa naniesli na 2% agarózový gél a po aplikácii napätia 100 V sa separovali gélovou elektroforézou asi 20 minút. 3.8 Čistenie PCR na sekvenovanie Aby sa zabránilo prekrývaniu signálov počas sekvenovania, musí byť produkt PCR pred sekvenčnou reakciou purifikovaný z primérov, prebytočných nukleotidov, solí a Taq polymerázy. 33

Materiál a roztoky: 3,85 μl aqua bidest 0,1 μl 1U/μl SAP 0,05 μl 1U/μl 200U/μl Exo I 0,5 μl Exo I tlmivý roztok 0,5 μl SAP tlmivý roztok 5 μl produkt PCR Postup: Na enzymatické čistenie sa reakčná zmes s celkovým objemom 10 ul zahrievala v termálnom cyklovači na 30 minút na 37 ° C a potom na 15 minút na 85 ° C. 3.9 Sekvenovanie DNA Metóda sekvenovania podľa Sanger et al. (106, 107), ktorý je tiež známy ako terminácia reťazca alebo dideoxynukleotidová metóda, je možné analyzovať jednovláknové cdna a gdna, ktoré sú prítomné ako jednovláknové v sekvenčnej reakcii kvôli denaturácii. Použitím dideoxynukleotidov označených fluorescenciou (každý zo štyroch ddntps je spojený s iným fluorescenčným markerom) môže sekvenčná reakcia prebiehať v reakčnej zmesi, pretože detekcia pásov pre každý zo štyroch ddntps vedie k odlišnému farebnému signálu. Materiál a roztoky: 2 μl 10 mm primer TP362/TP363 2 μl enzymaticky čisteného produktu PCR 8 μl aqua bidest 34

Overte amplifikácie a straty v rezoch DNA. Interfázy FISH sa uskutočňovali na rezoch TMA pomocou súpravy Histology FISH Accessory Kit (Dako, Hamburg, Nemecko) podľa pokynov výrobcu. Na detekciu amplifikácií a delécií sa použili sondy FISH uvedené v tabuľke 3-4. Hybridizácia prebiehala na automatických hybridizačných strojoch (Dako, Hamburg, Nemecko) a láskavo ju poskytla Dr. Dido Lenze, Ústav pre patológiu, Charité - Universitätsmedizin Berlín. Tabuľka 3-4 Zhrnutie použitých sond FISH Detekcia a kvantifikácia signálu sa uskutočňovali na prístroji Axio Imager Z1 (Zeiss, Jena, Nemecko) a na softvéri Isis (verzia 5.3.1, MetaSystems, Altlussheim, Nemecko). Na vyhodnotenie počtu kópií každej jednotlivej vzorky sa spočítali signály špecifické pre gén a centroméru v 20 neprekrývajúcich sa jadrách nádorových buniek. Teraz sa signály špecifické pre gény porovnali so signálmi špecifickými pre centroméry (počet kópií génov: počet kópií chromozómov). Amplifikácia bola kvocient> 2,2 a kvocient 50%. 50

Obrázok 4-6 Súhrn mutačnej analýzy IDH-1 a IDH-2 s reprezentatívnymi príkladmi mutácií v génoch IDH-1 a IDH-2. 54