Identifikácia a charakterizácia variantov ATP13A2 a ich význam pre

Identifikácia a charakterizácia variantov ATP13A2 a ich význam pre neurodegeneratívne choroby Úvodná dizertačná práca na získanie doktorandského titulu na Fakulte matematiky a prírodných vied na Kolínskej univerzite, ktorú predložil André Heimbach z Essenu v Kolíne nad Rýnom 2009

identifikácia

Táto dizertačná práca bola pripravená so súhlasom Fakulty matematiky a prírodných vied Univerzity v Kolíne nad Rýnom na Ústave pre genetiku človeka (riaditeľ: prof. Dr. Brunhilde Wirth) z univerzity v Kolíne nad Rýnom pod vedením prof. Dr. Thorsten Hoppe a prof. Dr. Christian Kubisch vyrobený. Recenzent: Prof. Dr. Thorsten Hoppe prof. Dr. Christian Kubisch Deň poslednej ústnej skúšky: 12. januára 2010

Obsah Obsah Obsah Zoznam skratiek 1 Úvod 1 1.1 Neurodegeneratívne choroby 1 1.1.1 Parkinsonizmus 1 1.1.2 Kufor-Rakebov syndróm a ATP13A2 5 1,2 ATPázy typu P 6 1.2.1 Transport materiálu cez biologické membrány 6 1.2.2 Čerpadlá poháňané ATP 6 1.2.3 Štruktúra ATPáz typu P 7 1.2.4 Funkčný mechanizmus ATPáz typu P 8 1.2.5 Klasifikácia ATPáz typu P 10 1.2.5.1 ATPázy typu I 11 1.2.5.2 ATPázy typu II 11 1.2.5.3 ATPázy typu III 11 1.2. 5.4 ATPázy typu IV 12 1.2.5.5 ATPázy typu V 12 1.2.6 Mutácie v ATPázach ako pôvodcovia chorôb 13 1.3 Ciele práce 15 2 Materiály a metódy 16 2.1 Chemikálie 16 2.2 Spotrebný materiál 16 2.3 Všeobecné roztoky 16 2.4 Enzýmy 17 2.5 Komerčné reagenčné systémy ( Súpravy) 17 2.6 Deoxyribonukleotid trifosfáty (dntp) 17 2.7 Klonovacie vektory 18 2.8 Použité zariadenia 18 2.9 Databázy a iné webové stránky 19 2.10 Softvér 20 2.11 Molekulárne biologické metódy 20 2.11.1 Polymerázová reťazová reakcia (PCR) 20 2.11.2 Dizajn primeru 20 2.11.3 PCR reakčné šarže 21 I

Zoznam skratiek Zoznam skratiek A absorpcia A adenín AA aminokyselina A. destilovaná voda Obr. Obrázok AK protilátka ABI Applied Biosystems AP alkalická fosfatáza ATP adenozíntrifosfát BAC bakteriálny umelý chromozóm BCA kyselina bicinchonínová (kyselina bicinchoninová; kyselina 2,2-chinolín-4,4-dikarboxylová) bp bázické páry BSA hovädzí sérový albumín (hovädzí sérový albumín) C cytozín cdna DNA kópia zmesi RNA-heterozygotnej DAPI 4 6-diamidino-2-fenylidol ddntp dideoxynukleotid trifosfát Del Delécie DMEM Dubecco s Modifikované Eagle médium DMSO dimetylsulfonoxid DNA deoxidácia 5 trifosfátových dpc dní po koite DTT Detiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Kyselina etyléndiamíntetraoctová EF embryonálne podporné bunky (myšie) ER endoplazmatické retikulum ES embryonálne kmeňové bunky (myšie) F dopredu primér (primér v smere dopredu) F z F c FKS G. G väzba antigénu Fragment konštantného podielu protilátky f etanové teľacie sérum guanín gramy V

Zoznam skratiek h hodina HCl kyselina chlorovodíková HEK ľudská embryonálna oblička (ľudské embryonálne pečeňové bunky) het heterozygot hom homyygotná HRP chrenová peroxidáza (chrenová peroxidáza) H 2 O voda IgG imunoglobulín zo skupiny G IgM imunoglobulín zo skupiny M IHF integračný hostiteľský faktor J Joule k kilo kb kilobázové páry kda kilodaltony KO knock out KRS Kufor-Rakebov syndróm 1 liter LAMP s lyzozómom spojený membránový proteín LB Luria Bertani m milli (faktor 10-3) M molárny ma milli-ampér Mb megabázové páry min minúty MMC mytomycín C MOPS kyselina 3-N-morfolino-propánsulfónová MPTP 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridín MTT 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazóliumbromid, nano (faktor 10-9), N normálny NaCI soľný roztok NADH nikotínamid adenín dinukleotid NADPH nikotínamid adenín dinukleotid fosforečnan NaOH hydroxid sodný Neo neomycín OD n optická hustota (absorbancia pri vlnovej dĺžke n nanometrov) p piko (faktor 10-12) VI

Zoznam skratiek PAA PAGE PCR PD PDI ph PIC R rh RNáza rpm RT SDS sek T TAE Taq TE TM U UPS UV V WT w/v polyakrylamid polyakrylamid gélová elektroforéza polymerázová reťazová reakcia Parkinsonova choroba (Parkinsonova choroba) disulfidová bielkovina izomeráza negatívny dekadický logaritmus proteázových koncentrácií vodíka -Inhibítorový kokteil reverzný primer (primer v opačnom smere) relatívna vlhkosť (relatívna vlhkosť) otáčky ribonukleázy za minútu (otáčky za minútu) izbová teplota dodecylsulfát sodný sekundy tymín tris-acetát-EDTA jednotka transmembránovej domény Tris-EDTA - definovaná jednotka aktivity aktivity ubikvitínu Systém proteazómu ultrafialové svetlo volty divokého typu hmotnosť na objem VII

Materiál a metódy 2. Materiál a metódy 2.1 Chemikálie Chemikálie, organické látky a rozpúšťadlá s analýzou označenia kvality boli použité a získané od nasledujúcich spoločností: Amersham (Freiburg) AppliChem (Darmstadt) BD Biosciences Clontech (Heidelberg) Calbiochem (Darmstadt) Difco Lab (Sparks/USA) Fermentas Life Sciences (St. Leon-Rot) Fluka (Taufkirchen) GE Healthcare (Mníchov) Invitrogen (Karlsruhe) Merck (Darmstadt) New England Biolabs (Frankfurt nad Mohanom) Perkin Elmer (Massachusetts/USA) Pierce (Rockford)/USA) Roche (Mannheim) Sigma-Aldrich (Taufkirchen) 2.2 Spotrebný materiál Plastový tovar a reakčné nádoby sa získali od spoločností Greiner (Frickenhausen) a Sarstedt (Nümbrecht). 2.3 Všeobecné roztoky Pokiaľ nie je v protokole uvedené inak, bola pre všetky pufre, roztoky a médiá použitá destilovaná voda (A. dest). TE pufor (ph 8) 10 mm Tris-HCl 1 mm EDTA a 500 ml HPLC-H20, sterilný filter, skladovanie pri -20 ° C TE -4 pufor (ph 8) 10 mm Tris-HCl 0,1 mm Na 2-EDTA sterilný filter, skladovateľný pri -20 ° C 10 X PBS (ph 7,4) 80 g NaCl 2 g KCl 14,4 g Na2HPO 4 2,4 g KH2P04 autokláv na 1 l H20, Skladovanie pri RT 16

Materiál a metódy 2.7 Klonovacie vektory Tabuľka 2.2: Použité vektory (vektorové mapy v prílohe) Názov Popis Veľkosť [bp] Zdroj pcdna 3.1 V5/His expresný vektor 5523 Invitrogen pdonr221 Klonovací vektor 4762 Invitrogen pcdna-dest53 Expresný vektor 7767 Invitrogen PPNT zameriavací vektor 7200 AG Zimmer pdonr221 -Vektor 7314 AG Brüning 2.8 Použité prístroje Tab. 2.3: Použité technické prístroje Model prístroja Výrobca Autokláv Parný sterilizátor Varioklav H + P Laboratórna technológia Inkubátor Hera Cell 150 Termoelektroforézna komora Sub-Cell GT Bio-Rad X-Cell Sure Lock Elektroporačné zariadenie Invitrogen Gene Pulser System Biorad Capacitance Extender Vyvíjací stroj Biorad Curix 60 Počítadlo Agfa Geiger LB 124 Gélový dokumentačný systém Berthold Biorad Ohrievacia/miešacia doska Biorad MR 3001 Heidolph hybridizačná skrinka typ 30 Špeciálna inkubačná trepačka Hyb Bachofer Innova 44 mikroskop Axioplan2 Zeissov prístroj na meranie nukleových kyselín/proteínov Nano Drop ND-1000 New Brunswick S. cientific PeqLab ph meter inolab ph level 1 WTW pipetting aid Research Eppendorf Real-Time PCR System Easypet 7500 Real Time PCR System (Taq-Man) Eppendorf ultračistý vodný systém Milli-Q; 18. Q-Gard 2 Millipore Roller Shaker Roller Mixer SRT 1 Stuart Applied Biosystems

Materiály a metódy Sekvencer ABI Prism 3100 Genetický analyzátor Applied Biosystems Napäťové zariadenia Power Ease 500 Invitrogen Power Pac Basic Bio-Rad sterilný pracovný stôl Hera Safe KS 12 Kendro Thermoblock Heatblock II VWR Thermocycler icycler Biorad Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems Thermomixer compact Eppendorf bench shaker KS 260 basic Stolná odstredivka IKA Galaxy Mini Prenosový modul VWR Blok X-Cell II Blotový modul Invitrogen Ultrazvukový kúpeľ USC 100T VWR Ultracentrifuga Avanti J 20 XPi Beckman Coulter UV zosieťovač CL-1000 UV zosieťovač UVP UV komora GS Gene Linker UV komora Bio Rad Vortex Reax Top Heidolph Waage Acculab Váhy Vicon Sartorius (presné váhy) ARJ 120-4M Kernov vodný kúpeľ WB22 Odstredivka Memmert Centrifuge 5415D Eppendorf Centrifúga 5415R Eppendorf Allegra X-22R Beckman Coulter Varifuge 3.0 RS Kendro 2.9 Databázy a ďalšie webové stránky Centrum zdrojov BACPAC BDGP BioTools: wwwtacg v3.0 CBS. NEB P-Type ATPázy UCSC Vector Designer http://bacpac.ch ori.org/ http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html http://biotools.umassmed.edu/tacg/wwwtacg.php http://www.cbs.dtu.dk/services/ http: //www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.neb.de http://biobase.dk/

exe/patbase.html http://genome.cse.ucsc.edu/index.html https://vectordesigner.invitrogen.com/login.cfm 19