Imunohistochemická a bunková biologická analýza ľudských monoklonálnych protilátok proti kolorektálnemu karcinómu

Z Patologického inštitútu výkonnej rady univerzity vo Würzburgu: profesor Dr. med. H.K. Müller-Hermelink Imunohistochemická a bunková biologická analýza ľudských monoklonálnych protilátok proti kolorektálnemu karcinómu Úvodná dizertačná práca na získanie doktorátu na Lekárskej fakulte Bavorskej univerzity Juliusa Maximiliána vo Würzburgu, ktorú predložila Judith Lorenz z Fulda Würzburg, jún 2004.

bunková

Rečník: profesor Dr. rer. nat. DR. med. H.P. Vollmerov spolurozhodca: profesor Dr. med. H.K. Müller-Hermelink dekan: profesor Dr. med. S. Silbernagl Deň ústnej skúšky: 21. januára 2005 Kandidátom je doktor

moji rodičia, Ulrich a Christian

Obsah 1 Úvod 1 1.1 Kolorektálny karcinóm 1 1.2 Monoklonálne protilátky 6 1.3 Cieľ práce 11 2 Materiál a metódy 12 2.1 Materiál 12 2.1.1 Pufre, roztoky a médiá 12 2.1.2 Chemikálie a protilátky 13 2.1.3 Ľudské monoklonálne protilátky 14 2.1 .4 Bunkové línie 15 2.1.5 Spotrebný materiál a laboratórne vybavenie 15 2.1.6 Softvér a hardvér 16 2.2 Metódy imunohistochémie 17 2.2.1 Príprava zmrazených rezov 17 2.2.2 Ficoll gradient a príprava cytospínov 17 2.2.3 Imunoperoxidázové farbenie kryosekcií a cytospínov 18 2.3 Metódy bunkovej biológie 20 2.3.1 Bunková kultúra 20 2.3.2 Proliferačný test (MTT Assay) 20 2.3.3 Detekcia bunkovej smrti ELISA PLUS (Roche, Mannheim) 21

3 Výsledky 23 3.1 Imunoperoxidázové farbenie 23 3.1.1 Kolorektálne karcinómy 24 3.1.2 Normálne tkanivo 28 3.1.3 Fetálne tkanivo 34 3.1.4 Nádorové tkanivo 35 3.2 Proliferačný test (MTT test) 39 3.3 Detekcia bunkovej smrti ELISA PLUS (Roche, Mannheim) 42 4 Diskusia 45 5 Zhrnutie 58 6 Bibliografia 59 7 Zoznam skratiek 75 Poďakovanie CV

Úvod 11 1.3 Cieľ práce V tejto práci boli tri ľudské monoklonálne protilátky, ktoré boli vyvinuté v pracovnej skupine prof. Dr. H.P. Vollmers na Patologickom ústave univerzity vo Würzburgu pomocou hybridomovej technológie (opísaná v: Vollmers et al., 1989) boli izolovaní od pacienta s rakovinou konečníka, vyšetrení s ohľadom na skríženú reaktivitu so zdravým a malígnym degenerovaným tkanivom. Na tento účel sa imunoperoxidázové farbenie uskutočnilo na zmrazených rezoch rôznych normálnych a fetálnych tkanív a na mnohých druhoch nádorov. Ďalej je vplyv protilátok na rastové správanie rôznych bunkových línií karcinómu hrubého čreva charakterizovaný in vitro pomocou dvoch funkčných bunkových biologických testov (MTT test, Cell Death ELISA PLUS). Údaje získané prostredníctvom tejto práce by mali poskytnúť počiatočné informácie o vhodnosti protilátok ako terapeutických látok pre zhubné nádory hrubého čreva, a tak možno tvoriť základ pre ďalšie výskumné prístupy.

Materiál a metódy 12 2 Materiál a metódy 2.1 Materiál 2.1.1 Pufre, roztoky a médiá PBS: 8 g NaCl 0,2 g KCl 1,15 g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 0,2 g KH 2 PO 4 1 l A. uchádzač. Tris/NaCl: Roztok 1: 4,5 l A. redist. 40,5 g roztoku NaCl 2: 1 l A. redist. Upravte 6 g tris (hydroxymetyl) aminometánu na pH 7,6 dymením HCl, upravte roztok 1 a 500 ml roztoku 2 na pH 7,4. BSA/PBS: 5 mg BSA (hovädzí albumín, frakcia V; Roth, Karlsruhe)/ml činidla PBS DAB: 5 ml vody z vodovodu 1 tableta DAB, 1 tableta peroxidu vodíka (5 ml tableta 3,3'-diaminobenzidínu Sigma Fast; Sigma, Steinheim) Činidlo MTT: 3- (4,5-dimetyltiazol-2- yl) -2,5-difenyltetrazóliumbromid (Sigma, Steinheim) 5 mg/ml PBS sušené odstredené mlieko: zo skladu zdravej výživy, 3 alebo 5% v PBS

Materiál a metódy 13 Trypánová modrá: 0,5% Trypánová modrá (Sigma, Steinheim) 0,9% NaCl Králičie sérum: Linaris, Wertheim-Bettingen Ľudské sérum: z Oddelenia transfúznej medicíny na univerzite vo Würzburgu RPMI 1640: základné médium (500 ml) (PAA Laboratories, Linz/Rakúsko) 1% glutamínu (5 ml) 1% penicilínu/streptomycínu (5 ml) 10% FCS (fetálne teľacie sérum) (50 ml) pred použitím predhrejte na 37 ° C Trypsin/EDTA: PAA Laboratories, Linz/Rakúsko 2.1. 2 Chemikálie a protilátky Chemikálie a protilátky boli získané od nasledujúcich spoločností: Acetone Cell Death Detection ELISA PLUS DMSO (dimetylsulfoxid) Fico Lite H Separačné médium Glycerínová želatína Haemalaun Tissue-Tek Mallinckrodt Baker, Deventer/Netherlands Roche, Mannheim Merck, Darmstadt Linaris, Wertheim-Bettingen Merck, Darmstadt Merck, Mníchov Sakura Finetek, Zoeterwoude/Holandsko Anti-Cytokeratin (CAM 5.2) Reagent Becton Dickinson, Belgicko

Materiál a metódy 15 2.1.4 Bunkové línie Pokusy sa uskutočňovali na zavedených líniách HT-29, CACO-2, COLO 206F a COLO 320. Okrem COLO 320 všetky vykazujú adherentný rast vo kultivačnej fľaši. Kultivácia prebiehala v médiu RPMI 1640 médium/1% glutamín/1% penicilín/streptomycín/10% FCS pri 37 ° C a 7% CO 2. 2.1.5 Spotrebný materiál a laboratórne vybavenie Spotrebný materiál dodávali tieto spoločnosti: Combitips pipety krycie poháre počítacia komora Neubauer Sklíčka, pipetovacie špičky, reakčné nádoby a plastové nádoby, S-monovety a kanyly, doštičky a fľaše na bunkové kultúry, karty cytofiltra, Eppendorf, Hamburg, Asociácia laboratórnych odborníkov Hartenstein, Würzburg Menzel; Langenbrinck, Emmendingen Greiner, Frickenhausen; Hartenstein, Würzburg Greiner, Frickenhausen; Hartenstein, Würzburg Sarstedt, Nümbrecht Greiner, Frickenhausen Hartenstein, Würzburg Zariadenia použité pri práci pochádzajú od týchto spoločností: Aquabidest system Milli-Q Plus PF inkubátory Čítačky ELISA Millipore, Molsheim Heraeus, Hanau Bio-Rad, Mníchov

Materiál a metódy 16 Mraznička (-70 ° C) Kryostat 2800 Frigocut N Chladnička a mraznička Magnetické miešadlo Mikroskop IKAMAG RTC DMLB fázový kontrastný mikroskop DMIL ph-meter ph 525 pipety pipetovacia pomôcka accu-jet sterilná lavica Lamin Air Vortex-Genie rovnovážny vodný kúpeľ Minitherm 2 odstredivky Minifuge T cytospin odstredivka 2 Héraus, Hanau Reichert-Jung, Nussloch Quelle, Fürth Janke & Kunkel, Staufen Leica, Wetzlar Leica, Wetzlar WTW, Weilheim i. Starosta Eppendorf, značka Hamburg, Wertheim/Main Heraeus, Hanau Bender & Hobein, Zürich/Švajčiarsko Sartorius, Göttingen Dinkelberg-Labortechnik, Neu-Ulm Heraeus, Hanau Shandon, Veľká Británia 2.1.6 Softvér a hardvér Pre grafické znázornenie výsledkov slúži Použité programy EXCEL a POWERPOINT (Microsoft, USA). Fotografické záznamy tkanivových rezov boli urobené pomocou digitálneho fotoaparátu Nikon Coolpix 990 (Nikon, Japonsko) a mikroskopu DMLB (Leica, Wetzlar) v 100, 200 a 400-násobnom zväčšení a výtlačok bol urobený na fotopapier (Hewlett Packard, USA). farebnou tlačiarňou rovnakej značky.

Výsledky 25 Výsledky farbenia pomocou HH 98/81-33-154 a HH 99/71-81-149 boli identické, a keď tieto dve protilátky reagovali pozitívne, bolo farbenie pomocou HH 101/99-14 tiež pozitívne . To bol prípad celkovo 7 karcinómov. Obrázky 1 až 4 každý ukazujú príklad pozitívneho farbenia s HH 98/81-33-154 a HH 99/71-81-149, ako aj slabšej a silnejšej reakcie HH 101/99-14 na tkanivo kolorektálneho nádoru. Pre porovnanie, negatívne reakcie všetkých troch protilátok s neoplastickým tkanivom hrubého čreva sú znázornené na obr. a b c Obrázok 1: Zväčšenie hrubého čreva adenokarcinómu: stokrát: a: pozitívna kontrola (CAM 5.2) b: negatívna kontrola (L11/64-28) c: pozitívna reakcia s protilátkou HH 98/81-33-154

Výsledky 26 abc Obr. 2: Zväčšenie hrubého čreva adenokarcinómu: 10x a: Pozitívna kontrola (CAM 5.2) b: Negatívna kontrola (RPMI 1640) c: Pozitívna reakcia s protilátkou HH 99/71-81-149 abc Obr. 3: Zväčšenie hrubého čreva adenokarcinómu: 10-násobok a: pozitívna kontrola (CAM 5.2) b: negatívna kontrola (L11/64-28)) c: slabo pozitívna reakcia s protilátkou HH 101/99-14

Výsledky 27 a b c d Obr. 4: Adenokarcinóm slepého čreva obsahujúci bunky signetových krúžkov Zväčšenie: 200-krát a: HE farbenie b: pozitívna kontrola (CAM 5.2) c: negatívna kontrola (RPMI 1640) d: silne pozitívna reakcia s protilátkou HH 101/99-14

Výsledky 28 abcd Obr. 5: zväčšenie hrubého čreva v normálnom tkanive: 200 krát a: negatívna kontrola (L11/64-28) b, c, d: negatívne reakcie protilátok HH 98/81-33-154, HH 99/71-81-149 a HH 101/99-14 s neoplastickými črevnými žľazami 3.1.2 Normálne tkanivo Pretože antigény spojené s nádorom rozpoznávané protilátkami môžu byť molekuly, ktoré sú exprimované aj zdravými bunkami, je potrebné identifikovať možné krížové reakcie Odhaliť protilátky s dôležitými orgánmi, aby bolo možné urobiť prvotné závery o kompatibilite protilátok pri neskoršom terapeutickom použití.

Výsledky 30 Orgán č. HH 98/81-33-154 HH 99/71-81-149 HH 101/99-14 nájdené. + + + Dvojbodka 3 0 3 0 3 0 3 Rektum 3 0 3 0 3 0 3 Pankreas 2 0 2 0 2 0 2 Pečeň 3 nie je možné vyhodnotiť Slezina 3 sa nedá vyhodnotiť Týmus 3 0 3 0 3 0 3 Tonsilla 3 0 3 0 3 0 3 lymfatické uzliny 3 0 3 0 3 0 3 nadobličky 3 0 3 0 3 0 3 obličky 3 0 3 0 3 0 3 močový mechúr 3 0 3 0 3 0 3 ductus deferens 3 0 3 0 3 0 3 prostata 3 0 3 0 3 0 3 semenníky 3 0 3 0 3 0 3 prsník 3 0 3 0 3 0 3 vaječník 3 0 3 0 3 0 3 tuba uterina 3 0 3 0 3 0 3 corpus uteri 2 0 2 0 2 0 2 cervix uteri, portio vag. 2 0 2 0 2 0 2 pokožka 3 0 3 0 3 0 3 kostrový sval 3 0 3 0 3 0 3 placenta 1 0 1 0 1 0 1 miecha 3 0 3 0 3 3 0 mozgová kôra 3 0 3 0 3 1 2 mozoček 3 0 3 0 3 3 0 Corpus pineale 2 0 2 0 2 2 0 Hypofýza 3 0 3 0 3 3 0 Kostná dreň 2 0 2 0 2 0 2 Krv 2 0 2 0 2 0 2