Injekcia inzulínu a extrakcia hemolymfy na meranie citlivosti na inzulín u dospelých Drosophila

Zhrnutie

Zachované signálne dráhy inzulínu, ktoré sa nachádzajú v ovocnej muške Drosophila melanogaster, robia z tohto organizmu potenciálny nástroj na modelovanie metabolických chorôb, ako je cukrovka typu II. Na tento účel je dôležité ustanoviť fyziologické testy na účinné meranie systémových účinkov inzulínu na periférnu glukózu, ktorá je k dispozícii pre dospelú mušku.

Abstrakt

Protokol

1. Inzulín na prípravu roztoku

1. Pripravte čerstvý hovädzí inzulín rozpustením inzulínu v PBS, aby ste dosiahli koncentráciu 0,01 mg/ml. Počas injekcie musia byť roztoky inzulínu/PBS a kontrolného PBS držané na ľade. Tieto roztoky by sa nemali pripravovať s 0,5% (obj.) FD&C Blue. 1 potravinárske farbivo.

2. Príprava ihly a nastavenie injekcie

1. Na injekčné experimenty sa používajú desaťdenné mušky. Muchy zbierajte do 24 hodín od vyliahnutia. Anestetizujte mušky navlhčeným CO 2 na plynovej podložke, vytriedte mužov a samice mušiek umiestnite do liekoviek so štandardnou alebo liečebnou stravou. Udržujte mušky na experimentálnych diétach 10 dní.
2. Desiaty deň po vyliahnutí a rozdelení na experimentálnej strave sa muchy prevedú z liekoviek obsahujúcich potraviny do liekoviek s 5 ml zátkou obsahujúcou 2% agaru a nechajú ich 12-16 hodín hladovať.
3. Ampulky s hladovými muškami preneste pred injekciou inzulínu na 1 hodinu do 10% filtrov nasiaknutých glukózou.
4. Po prívode glukózy muchy krátko anestetizujte zvlhčeným C02 a potom ich studené znehybnite na ľade.

1. Uchopte mušku imobilizovanú za studena jemnými kliešťami a hrot ihly držte blízko, aby bol hrot vedľa prednej oblasti ľavej strany hrudníka muchy. Pod stereomikroskopom zaostrite hrot ihly aj muchu.
2. Posuňte mušku smerom k hrotu ihly tak, aby sa hrot ihly dotýkal stredu hrbolčekov ľavej predrezovanej oblasti muchy hrudníka (obr. 1). Potom, čo je muška správne vyrovnaná a v jednej línii s hrotom ihly, muška pokračuje na ihle tak, že ihla napáda stred predkusu dopredu.
3. Vyvíjajte pozitívny tlak vysunutím piestu injekčnej striekačky pomocou mikroinjektora pomocou tlačidla mikromanipulátora, až kým nebude za chodu vstreknuté 0,1 μl kvapaliny. Prietok tekutiny v hemocoeli muchy prepožičiava modrej farbe ľavú stranu predného hrudníka. Príležitostne musíte niekoľkokrát zatiahnuť a postúpiť, aby ste uvoľnili všetky blokády ihlových bodov a umožnili prietok.
4. Pred extrakciou hemolymfou nechajte injikované mušky v 2% agarových fľaštičkách pre špecifické časové body, aby sa zotavili.

6. Stanovenie hemolymfy glukózy

1. Vysuňte vzorky hemolymfy do jamiek na mikrotitračnej doštičke so 100 μl činidla Infinity Glucose. Pri vkladaní vzoriek hemolymfy držte platňu na ľade.
2. Vytvorte štandardnú krivku samostatným zavedením 1 μl každého zo zásobných roztokov glukózy pri 50 mm, 25 mm, 12,5 mm, 6,25 mm a 3,125 mM.
3. Inkubujte vzorky pri 37 ° C po dobu 10 minút.
4. Zistite absorpciu pri 340 nm.
5. Zohľadnite zhromaždený objem hemolymfy a stanovte koncentráciu glukózy vo vzorke na základe štandardnej krivky so známymi koncentráciami glukózy.

7. Reprezentatívne výsledky

Typická odpoveď na inzulínovú toleranciu je u inzulínových injekčných mušiek, kde sa pokles cirkulujúcich hladín glukózy zistí 15 minút po injekcii. Naproti tomu takáto reakcia nie je u múch injikovaných PBS (obr. 3). Táto reakcia v periférnej glukóze dostupnej v injekcii inzulínu pokračuje až 30 minút po injekcii. Pravidelne extrahujeme 0,2-0,5 μl hemolymfy na 4-5 múch v každej injekčnej skupine. V každom experimente sú zahrnuté tri injekčné skupiny.

ilustrácia 1. Ľavá strana hrudníka Drosophila zobrazujúca miesto vpichu ihly (Modifikované z Demerca, 1950) 7. Ihlu vpichneme stredom preskutu v prednej, zadnej časti ľavej strany hrudníka.

Obrázok 2. Pohľad spredu na hlavu Drosophila zobrazujúci miesto vpichu na extrakciu hemolymfy (upravené podľa Demerca, 1950) 7. Punkcia hlavovej kapsuly jemne zomletou volfrámovou sondou do stredu hlavovej kapsuly nad stehennou suturou.

Obrázok 3. Typickou odpoveďou na inzulínovú toleranciu zistenou u dospelých dospelých sú muchy. Kontrolným myšiam 1118 sa injikoval iba hovädzí inzulín (1 ng v PBS) alebo iba PBS. Muchy v replikovaných skupinách boli potom merané po dobu 0, 15 alebo 30 minút a znovu boli v obehu hladiny glukózy.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Technika opísaná v tejto správe je potenciálne užitočná v každej štúdii, ktorá skúma fyziologické procesy vedúce k zistiteľným zmenám v zložení hemolymfy Drosophila. Kombináciou injekcie a zhromažďovania hemolymfy týmto spôsobom je možné určiť okamžité fyziologicky významné účinky konkrétneho experimentálneho ošetrenia alebo manipulácie. Primárnou výhodou tejto „krvotvornej“ techniky pri odbere hemolymfy v porovnaní s predchádzajúcimi postupmi zahŕňajúcimi dekapitáciu 2 je to, že táto technika minimalizuje kontamináciu vzoriek hemolymfy dobrým obsahom. Ak sa dá vyhnúť pericerebrálnemu tuku, ktorý je niekedy v tele Zdá sa, že zhromažďujú vyžarované kvapky hemolymfy, potom by vzorky mali presne odrážať stav obehových tekutín in vivo.

Potenciálne mätúcim faktorom uskutočneným v dôsledku injekčného experimentu v tomto rozsahu je prvé zriedenie celkových obehových tekutín po injekcii. To sa dá ľahko kontrolovať, ale po injekcii rovnakého objemu PBS do experimentálnych mušiek alebo inzulínu do vekovo zhodných kontrol a normalizačných výsledkov. Na zabezpečenie reprodukovateľných hodnôt cirkulujúcej glukózy má kvalita kvapiek hemolymfy mimoriadny význam. Na stanovenie glukózy by sa mali zaznamenávať iba čisté kvapky hemolymfy bez pericerebrálnych tukových telies alebo iných zvyškov tkaniva. Je tiež pozoruhodné, že pred stanovením relatívnych koncentrácií glukózy by sa malo odobrať iba až 8 vzoriek. Zaznamenali sme „posun“ v hodnotách OD 340, keď boli vzorky hemolymfy ponechané na ľade dlhšiu dobu.

Náš protokol necháva dostatok priestoru na zmeny v dostupnom vybavení. Nastavenia sťahováka pipiet je potrebné zmeniť na základe modelu a stavu sťahováka. Zistili sme, že nastavenia pre výrobu adekvátnych ihiel na elektródu pre absorpciu elektródy sú ideálne pre injekčné ihly. Okrem toho, zatiaľ čo sme na udržiavanie polohy ihly pod stereoskopom používali trojosový mikromanipulátor, je to možné dosiahnuť aj stabilným krúžkovým stojanom a upínacím systémom, keď ihla zostáva injekciou v pevnej polohe. Vysoký odpor použitých ihiel si vyžadoval vývoj alternatívnej metódy na stanovenie objemu vstrekovanej kvapaliny ako pohybu piestu injekčnej striekačky 1: 1, aby sa nedosiahol posun objemu. Vyvinuli sme mierku, ktorú bolo možné vytlačiť a rozložiť na boku ihly. V závislosti na použitom systéme môže byť potrebné vytlačiť trochu tekutiny z ihly za držiak ihly mikroinjektora, aby bolo možné kvapalinu menisku vyrovnať s gradáciami pomocou kalibračnej karty pripevnenej k bočnej strane hrotu ihly.

Nakoniec sú v našom protokole zaznamenané dve obmedzenia tejto techniky. Najskôr sú zvyčajne povinní dvaja ľudia, aby koordinovali kroky injekcie aj extrakcie hemolymfy, aby sa maximalizoval počet spracovaných vzoriek. Po druhé, variácie v inzulínovej tolerančnej reakcii sa niekedy pozorujú v rámci rovnakého genotypu. Veríme, že prostredníctvom variabilných reakcií môžu jednotlivé mušky sledovať imobilizáciu ľadu a zotavenie na agare. Pred vyvodením spoľahlivých záverov by sa preto mal otestovať dostatočný počet vzoriek.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

---