Laboratórny vestník - Prehľad produktu - Súpravy na čistenie protilátok

súpravy

V akademických výskumných laboratóriách sa protilátky často čistia pomocou afinitných kolón. Foto: Floridská univerzita

(01.09.2020) Súpravy na čistenie protilátok sú väčšinou založené na malých rotačných kolónach alebo perličkách, ktoré sú vybavené proteínom A alebo G. Izraelská skupina vyvinula zaujímavú alternatívu bez chromatografie.

Aký by bol moderný výskum v oblasti vedy o živote bez polyklonálnych (pAb) alebo monoklonálnych protilátok (mAb)? Ak by ste všadeprítomnú PCR ignorovali, nezostalo by z nej príliš veľa. Sotva existuje experiment alebo test, do ktorého by sa nezapájali malí pomocníci, uľahčujúci výskumníkom život alebo umožňujúci ich experimenty. Protilátky sú nielen nevyhnutné v základnom výskume pre nespočetné množstvo metód a protokolov od imunotestov, Western blotov, ELISA a imunohistochémie až po mikroskopiu a zobrazovanie až po prietokovú cytometriu. Sú tiež dôležitými nástrojmi v klinickej diagnostike a čoraz viac sa používajú ako účinné látky alebo terapeutické protilátky na liečbu rôznych chorôb.

Jedným z najdôležitejších zdrojov polyklonálnych protilátok alebo imunoglobulínov (Ig) je krvná plazma cicavcov. Na základe hmotnosti predstavuje asi dvadsať percent proteínov, ktoré obsahuje, protilátky, ktoré sú rozdelené do piatich rôznych tried: IgA, IgD, IgE, IgG a IgM. Prvé tri tiež hrajú dôležitú úlohu v imunitnom systéme, ale IgG a IgM sa väčšinou používajú na výskumné účely. IgM sa objavujú v počiatočnej fáze primárnej imunitnej odpovede na antigén, zatiaľ čo IgG sa syntetizujú vo veľkých množstvách v následnej sekundárnej imunitnej reakcii.

Vedci to využívajú injekčným podaním antigénu králikom, kozám, ovciam alebo iným cicavcom a potom zvyčajne izolujú a čistia IgG tvorené počas imunitnej odpovede z plazmy alebo antiséra zvierat. V dobe pred súpravou najskôr vyzrážali plazmatické bielkoviny síranom amónnym, ktorý pridávali do konečnej koncentrácie 25 percent. Po centrifugácii a odstránení proteínov prišli na rad IgG, ktoré sa vyzrážali päťdesiatimi percentami síranu amónneho.

Dva kroky zrážania a následná dialýza získaného roztoku protilátky, aby sa zbavil síranu amónneho, si však vyžaduje veľa ručnej práce a trvá niekoľko dní. IgG sa dajú izolovať oveľa rýchlejšie a ľahšie pomocou súprav na čistenie protilátok, ktoré sú takmer úplne založené na malých afinitných kolónach alebo guľôčkach, ktoré sú vybavené proteínom A alebo proteínom G. Pôvodne pochádza zo Staphylococcus aureus (bielkovina A) a Streptococcus sp. (Proteín G) odvodené povrchové proteíny sa viažu s vysokou špecifickosťou na Fc časť mnohých IgG.

Zatiaľ čo proteín G má vysokú afinitu k väčšine IgG, proteín A je trochu prieberčivejší a je ťažko priťahovaný k IgG napríklad od škrečkov, potkanov alebo oviec. Na afinitné čistenie sa rekombinantne exprimované varianty proteínu A a G pripájajú k chromatografickým živiciam buď samostatne, alebo niekedy v kombinácii, alebo sa viažu na povrchový materiál magnetických guľôčok. Jediný chromatografický krok je často dostatočný na dosiahnutie čistoty izolovaných protilátok viac ako 98 percent.

Vo výskumných laboratóriách sa výrazne nestabilnejšie IgM, ktoré majú tendenciu agregovať, často čistia afinitnými stĺpcami. Tu použitou väzobnou matricou nie je proteín A alebo G, ale proteín viažuci manózu alebo lektín viažuci manózu (MBL), ktorý je väčšinou imobilizovaný na agaróze.

Pre čistenie vo väčšom meradle sú proteíny A a G alebo iné špecifické ligandy pre afinitnú chromatografiu dosť nákladné. Výrobcovia protilátok a farmaceutické laboratóriá preto väčšinou prechádzajú na klasickú iónomeničovú chromatografiu a kolóny plnia napríklad oveľa lacnejšími aniónomeničmi, ako je dietylaminoetyl (DEAE) agaróza, aby získali čisté IgG, IgM a najmä monoklonálne protilátky (mAb). Ale aj tieto techniky musia zápasiť so všeobecnými nevýhodami metód chromatografického čistenia - ako sú obmedzené väzbové kapacity, vysoké náklady na čas a nákladná údržba zariadení.

Niektoré skupiny preto vytrvalo pracujú na alternatívach k chromatografickým procesom, pričom sa riadia sloganom, ktorý je počuť čoraz častejšie: Všetko, iba žiadna chromatografia (Any else Chromatography, ABC). Jeden z týchto konceptov čistenia protilátok bez chromatografie predstavila minulý rok skupina Guy Patchornika z izraelskej Ariel University spolu s kolegami z Indie (MABS 11 (3): 583-92). Pretože protilátky môžu byť tiež purifikované pomocou hydrofóbnej interakčnej chromatografie (HIC), Patchornik predpokladal, že protilátky sa zjavne viažu o niečo silnejšie na hydrofóbne živice ako iné proteíny rozpustné vo vode. Podľa jeho nápadu by teda museli byť zachytené aj hydrofóbnymi agregátmi detergentov.

Zamestnanci spoločnosti Patchornik vytvorili agregáty tak, že najskôr pridali hydrofóbny chelátor bathofenantrolín (Batho) do vodného roztoku Tween-20 a zmes vortexovali. To im dalo Tween 20 micel, ktorých povrchy boli zdobené hydrofóbnou časťou molekúl Batho. Tieto zmiešané micely potom zmiešali s roztokom síranu železnatého a opäť vortexovali. Ďalšia reakcia potom prebiehala prakticky automaticky: Ióny Fe 2+ tvoria hydrofóbne (Batho) 3: komplexy Fe 2+ s molekulami Batho umiestnenými na fázovom rozhraní medzi micelami a vodou, čo vedie k zosieťovaniu micel za vzniku hydrofóbneho Tweenu. -20 jednotiek vedie.

Izraelci testovali, či sú agregáty vhodné na čistenie protilátok, pomocou zmesi polyklonálnych humánnych IgG obsahujúcich lyzát E. coli ako umelú kontamináciu. Postup čistenia, ktorý na to použili, je veľmi jednoduchý: zmes protilátok sa inkubuje päť minút s vopred pripravenými agregátmi Tween-20 a potom sa dve minúty odstreďuje. IgG sa potom môžu izolovať z agregátov za niekoľko minút s použitím 50 milimolárneho roztoku izoleucínu (pH 3,8). Celé to funguje aj v médiu bez séra bez hybridómu, ktoré sa zvyčajne používa na produkciu monoklonálnych protilátok, ako aj v prítomnosti bovinného sérového albumínu (BSA), ktorý sa tiež často nachádza v bunkových kultivačných médiách na produkciu protilátok.

Pretože čistota IgG izolovaných s agregátmi Tween 20 aj výťažok sú len okrajovo horšie ako pri afinitnej chromatografii na proteíne A, je Patchornik presvedčený, že jeho metóda je skutočnou alternatívou k bežnej purifikácii. Dokonca si mohol predstaviť, že nahradí piliere proteínu A pri čistení terapeutických protilátok.

Skupina Ana Cecílie A. Roquesovej na Universidade Nova v Lisabone sa vyhýba chromatografickému čisteniu protilátok kombináciou afinitného ligandu, precipitácie a magnetických nanočastíc (Biotechnol. J. DOI: 10,1002/biot.202000151).

Tri jednotlivé techniky samozrejme nie sú nové. Novinkou je však ich zlúčenie do podoby, ktorá je známa ako Affinity Magnetic Precipitation. V zásade je to mimoriadne jednoduché - najkomplikovanejším krokom je výroba magnetických nanočastíc vybavených triazínovým ligandom, ktorý sa špecificky viaže na protilátky.

Častice sa potom zmiešajú s 20% PEG3350, ktorý slúži ako zrazenina. Surový extrakt sa inkubuje so zmesou jednu hodinu pri 4 ° C a pretrepáva sa na orbitálnej trepačke. Potom sa na dobu pätnástich minút aplikuje magnetické pole, aby sa oddelili vyzrážané magnetické častice s protilátkami, ktoré sa na ne prilepili, od supernatantu. Protilátky sa potom z nanočastíc jemne odstránia neutrálnym roztokom PBS.

Použitím tejto metódy Roqueov tím izoloval polyklonálne protilátky z ľudského séra s 50-percentným výťažkom a čistotou osemdesiat percent. Portugalci dosiahli ešte lepšie hodnoty pri čistení monoklonálnych protilátok.


(Prvá publikácia: H. Zähringer, Laboratórny časopis 9/2020, od augusta 2020, všetky informácie bez záruky)


Posledné zmeny: 01.01.2020

© 1996-2020 Redakčný obsah: LJ-Verlag GmbH & Co. KG, Freiburg, dizajn a programovanie: f + r internetová agentúra, Freiburg,
Obrázky a grafiky - pokiaľ nie je uvedené inak - s príslušnými autormi a fotografmi.