Materiál a metódy PDF 3 - PDF na stiahnutie zadarmo
Stručný opis
1 3 Materiál a metódy 3.1 Experimentálne usporiadanie, živočíšny materiál, chov a kŕmenie V dvoch experimentálnych pokusoch .
Popis
Experimentálne usporiadanie, živočíšny materiál, chov a kŕmenie
Vplyv tráviacej viskozity na morfológiu a histológiu tenkého čreva ošípaných sa skúmal v dvoch testovacích cykloch. Na tento účel sa vytvorila kontrolná skupina a testovacia skupina, ktorá pozostávala zo šiestich ošípaných. V prvom testovacom behu sa podávala polosyntetická dávka na báze kukuričného škrobu a izolátu sójového proteínu (diéta C). Na zvýšenie zažívacej viskozity sa za vysoko viskózny modelový substrát karboxymetylcelulózu (diéta CMC) nahradili 2% kryštalickej celulózy. V druhom skúšobnom behu bola kŕmená strava, ktorá pozostávala hlavne z raže a pšenice, a teda obsahovala prírodné faktory zvyšujúce viskozitu (strava K). Viskozita trávenia testovanej skupiny (diéta E) sa znížila pridaním enzýmového prípravku obsahujúceho xylanázu (Zy 68; 480 IU/kg krmiva). Tabuľka 1 ukazuje zloženie rôznych diét; Tabuľka 2 ukazuje obsah živín a príslušné viskozity extraktu.
Tabuľka 1: Zloženie polosyntetických diét C a CMC, ako aj obilnín K a E.
Zložky [g/kg uS] kukuričný škrob raž pšeničný sójový proteín izolát celulóza, kryštalická1 karboxymetylcelulóza 2 glukózový sójový olej monokalciumfosfát kŕmne vápno, sýtená premix3 hydrogénuhličitan draselný oxid horečnatý lyzín metionín treonín tryptofán Zy 684
680 134 50 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
680 134 30 20 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 -
658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 0,4
1Viva Pur ® typ 200; Závod na výrobu celulózy Rettmaier & Sons, Ellwangen-Holzmühlen 2Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemecko 3Lohmann Animal Health & Co.KG, Cuxhaven; Obsah na kg: 1,2 milióna IU vitamínu A; 120 000 IU Vit D3; 4 g Vit E; 200 mg Vit B1; 600 mg Vit B2; 2 500 mg niacínu; 400 mg Vit B6; 4,5 mg Vit B12; 20 mg biotínu; 1 800 mg kyseliny pantoténovej; 160 gramov sodíka; 50 gramov horčíka; 10 gramov zinku; 7,5 g železa; 7,5 g mangánu; 150 mg jódu; 70 mg kobaltu; 40 mg selénu 4Lohmann Animal Health & Co. KG, Cuxhaven; Zy 68 obsahuje 1192 IU xylanázovej aktivity na g
Materiál a metódy Tabuľka 2: Analyzované a vypočítané obsahy živín v polosyntetických diétach C a CMC, ako aj v obilných diétach K a E.
Sušina dusíkaté látky tuk popol surová vláknina NfE NDF ADF celkový NSP1 (rozpustný)
900,7 115,0 19,9 44,6 (50) 4 671,2 * * *
896,6 116,2 25,3 32,8 (30) 4 692,3 * * *
Arabinóza (rozpustná) Xylóza (rozpustná) Manóza (rozpustná) Glukóza (rozpustná) Galaktóza (rozpustná) Konvertibilná energia [MJ/kg uS] 2 Zdanlivo presne stráviteľný surový proteín3 Viskozita extraktu [mPas]
901,9 131,9,9 32,9 51,3 17,0 668,6 145,9 27,4 103,4 (24,8) 19,4 (4,7) 50,2 (11,8) 4,0 (1,5) 26,0 (5,7) 3,8 (1,1) 13,4
898,9 131,9,9,4,4 49,7 17,3 668,6 134,6 28,0 102,6 (30,5) 19,1 (4,9) 49,4 (13,0) 2,7 (0,8) 27,8 (9,8) 3,6 (2,0) 13,4
1 stanovené ako je opísané v Bartelt et al. (2002) 2 vypočítané podľa energetického obsahu jednotlivých zložiek (DLG, 1991) 3 vypočítané podľa informácií o obsahu a stráviteľnosti surového proteínu v izoláte raže, pšenice a sójových proteínov v CVB (1996) a Grala et al. (1998) 4 nezodpovedá obsahu kryštalickej celulózy * v strave
24 testovaných zvierat boli ošípané z programu Schaumann. V tomto šľachtiteľskom programe sa krížové produkty rás Deutsche Landrace a Duroc používajú ako materská línia a krížové produkty závodov Landrace B a Hampshire ako otcovská línia. Všetky prasiatka dostali injekciu železo-dextrán vo veku troch dní; muži boli kastrovaní v 15. deň života. Šesť prasiatok bolo náhodne vybraných z dvoch simultánnych vrhov bez ohľadu na pohlavie a odstavené boli 28. deň života. Šesť súrodencov bolo rovnomerne rozdelených medzi kontrolnú a testovaciu skupinu (C alebo CMC alebo K alebo E). Obdobie kŕmenia trvalo tri týždne v obidvoch testovacích behoch. Ošípané boli umiestnené v jednotlivých boxoch s podlahovou plochou 1,20 x 1,60 ms úplne roštovou podlahou. Medzi susednými boxmi bol vizuálny kontakt. Ošípané z rôznych skupín nemali žiadny priamy kontakt. 29
Kŕmenie prebiehalo každý deň o 8:00 a 16:00, múčne krmivo sa zmiešalo s trojnásobným množstvom vody. Dávkové množstvo bolo prispôsobené príjmu potravy ad libitum tak, aby bolo prvý deň 100 g a posledný deň experimentu bolo priemerne 1100 g. Pred popoludňajším kŕmením sa boxy každý deň čistili vodou. Počas tejto doby boli tri boxy z každej kŕmnej skupiny navzájom spojené. Celkový stav ošípaných sa kontroloval každý deň. Počas troch týždňov experimentu mali prasatá k dispozícii rôzne hračky, ako napríklad loptičky, zaoblené kovové tyče alebo plastové disky. Zvieratá sa odvážili na začiatku experimentu, 28. dňa života a jeden deň pred koncom experimentu.
potom sa pozdĺžne otvorilo a nakoniec sa trikrát opláchlo vo vlažnom fyziologickom roztoku chloridu sodného. Črevné časti sa rozložili na papierové uteráky na meranie dĺžky a nechali sa tam asi päť minút sušiť. Jednotlivé časti sa potom odvážili. Všetky jednotlivé kroky uskutočňovala rovnaká osoba. Počas celého postupu bola venovaná pozornosť zvláštnostiam a makroskopicky rozpoznateľným, patologickým procesom. Hmotnosť a dĺžka jednotlivých črevných rezov v pomere k telesnej hmotnosti boli vypočítané neskôr z parametrov hmotnosti a dĺžky jednotlivých črevných rezov. Ďalej bol kvocient dĺžky a hmotnosti zaznamenaný ako miera hrúbky steny tenkého a hrubého čreva.
Meranie viskozity digescie
Odstránená tráviaca zmes sa ihneď po získaní ochladila na ľade, až kým sa vzorky centrifugovali pri 13 000 ot./min (relatívna odstredivá akcelerácia 13 600 g) počas 10 minút (centrifúga typu 5415 C z Eppendorfu v Nemecku). Viskozita 0,5 ml supernatantu sa stanovila pomocou viskozimetra (typ LVDV II; meracia hlava typu Cone vretena CP-40; temperovaná na 40,0 ° C, Brookfield, USA). Ak bolo k dispozícii dostatok materiálu vzorky, uskutočnili sa dvojité merania. U piatich zvierat nebol v čase odberu vzoriek prítomný v ileu žiadny tráviaci systém.
Na fixáciu (20 hodín pri teplote miestnosti) v modifikovanom Bouinovom roztoku (4% kyselina pikrová + 2,5% octan meďnatý + 3,5% formol) sa vzorky tkaniva natiahli na korkové doštičky s hrotmi ježka. Nasledovalo niekoľko opláchnutí 70% etanolom v priebehu 24 hodín. Prípravky sa ďalej dehydratovali celkovo 48 hodín pomocou množiny zvyšujúcich sa alkoholov (4-krát 2 hodiny 80%, 30 minút 90%, 2-krát 30 minút 96%, 4-krát 1 hodina 100% etanolu; vyčírenie xylénom I, II a III vždy 20 minút; zakaždým pri izbovej teplote). Po kúpaní v mäkkom parafíne s teplotou topenia 46 ° C boli vzorky ponorené do tvrdého parafínu pri 60 ° C (teplota topenia 57 ° C).
Tkanivové vzorky o veľkosti asi 1,5 cm2, natiahnuté na korkové platne, sa fixovali na 24 hodín v nasledujúcom roztoku: 2% paraformaldehyd + 2,5% glutaraldehyd v 0,1 M kakodylátovom pufri, pH 7,2. Potom sa niekoľkokrát prepláchli vyplachovacím pufrom uvedeným v kapitole 3.4.2 a postfixovali sa zodpovedajúcim roztokom oxidu osmičelého počas 2 hodín pri laboratórnej teplote. Po opakovanom opláchnutí sa vzorky premyli stúpajúcou sériou alkoholov (2 krát 30 minút 50 a 70%; 30 minút 80% etanol I, 16 hodín 80% etanol II, 2 krát 30 minút 90 a 96% a 4 krát 30 minút 100 % etanolu, každý pri 4 ° C), dehydratovaný. Nasledovalo 2-hodinové pôsobenie HMDS (1-1-1-3-3-3 hexametyldisilazán; Roth 3840,2) pri laboratórnej teplote pred tým, ako sa prípravky odparili cez noc (laboratórna teplota). Po nalepení prípravkov na platne so vzorkami pomocou vodivého cínu (Plano) sa skladovali vo vákuovej skrini až do naprašovania (jedna minúta; Sputter Coater S150B, Edwards Company, Anglicko).
Prehľad farbenia, ako aj dôkaz proliferácie a apoptózy pre svetelnú mikroskopiu
Pre morfologické a morfometrické vyšetrenia boli 5 um hrubé rezy zafarbené hematoxylínom-eozínom (HE). Ďalej boli rezy rovnakej hrúbky zafarbené Schiffovým činidlom periodickej kyseliny Alzianovou modrou (PAS-AB), pH 2,5. Tu použité farby farbia slizničné látky (mucíny) v pohároch odlišne v závislosti od ich hodnoty pH. To na jednej strane výrazne zjednodušuje identifikáciu pohárikovej bunky, na druhej strane sa kyslé mucíny javia modré, zatiaľ čo neutrálne mucíny červené (Romeis, 1989). Ďalšia diferenciácia mucínov sa neurobila. Na stanovenie rýchlosti proliferácie a apoptózy sa uskutočnili špeciálne dôkazy, ktoré sú jednotlivo opísané nižšie.
Detekcia proliferačne aktívnych buniek
Princíp detekčnej metódy Thymidínový analóg brómdeoxiuridín (BrdU) sa intraperitoneálne podával ošípanej pred zabitím po dobu jednej hodiny v koncentrácii 15 mg/kg živej hmotnosti. Počas tejto hodiny bol modifikovaný uridín zabudovaný do svojho genetického materiálu bunkami v S fáze bunkového cyklu. Začlenený BrdUridín je označený monoklonálnymi protilátkami z myši. Viazané primárne protilátky sú viditeľné metódou peroxidáza-anti-peroxidáza (PAP), čo je imunoglobulín králika slúžiaci ako premosťujúca protilátka (Romeis, 1989). Jadrá obsahujúce BrdU sú hnedé . Použité reakčné činidlá boli: SILÁNY: Sklíčka boli potiahnuté podľa pokynov spoločnosti Sigma A3648. TBS I: premývací pufer I (soľný roztok pufrovaný TRIS); 0,1 M TRIS + 0,1 M NaCI + 0,05 M MgCI; pH 7,5 Inkubačný pufor: 0,05 M TRIS + 0,9% NaCI + 0,66 mM MgCl2 + 1% BSA + 0,1% želatína (Merck 4078) TBS II: premývací pufor II; 0,05 M TRIS + 0,9% NaCI; pH 7,6 trypsín: 0,1% + 0,1% CaCl2 v TBS I (pH 7,6 až 7,8) SwNS: normálne bravčové sérum (DAKO X 0901); na predinkubáciu 20% v detekčných činidlách TBS I (inkubácia): Inkubácia I: MaBrdU (DAKO M 07444; myšia monoklonálna protilátka proti BrdU); 1:25 v inkubačnom tlmivom roztoku + 2% SwNS 33
Inkubácia II: RaMIg (DAKO Z 0259; protilátky králika proti imunoglobulínom myší); 1:40 v inkubačnom pufri + 2% inkubácia SwNS III: myšací PAP (DAKO B 0650); 1: 250 v inkubačnom tlmivom roztoku + 2% SwNS BSA:
hovädzí sérový albumín (Roth 8076.2)
Princípy detekčných metód Počas apoptózy vznikajú charakteristické fragmenty DNA z aktivity vlastných endonukleáz bunky. Jednou z možností histologickej detekcie týchto fragmentov je možnosť Gavrieli et al. (1992) opísali metódu TUNEL (značenie koncovým dUTP-biotínom s koncovou deoxynukleotidyl transferázou (TdT)). Je založená na špecifickej väzbe enzýmovej terminálnej deoxinukleotidyltransferázy (TdT) na 3'-OH konce DNA. Tento enzým spája biotínom značené deoxyuridíntrifosfáty (biotín-dUTP) s koncami fragmentov DNA. Biotín sa nakoniec zviditeľní podľa metódy PAP. Tu použitý komplex streptavidín-biotín, na ktorý sa chemicky viažu peroxidázy, nahrádza protilátky (Gavrieli a kol., 1992). V rámci iného spôsobu sa zisťuje prítomnosť enzýmu typického pre apoptózu, kaspáza-3. Enzýmy v cytoplazme sú označené pomocou špecifickej protilátky králika. Primárne protilátky sú viditeľné pomocou už spomenutej metódy PAP. Mostová protilátka použitá v tomto prípade pochádza z kozy.
Reakčné činidlá použité pre TUNEL boli nasledujúce: TBS: 0,05 M TRIS-HCl (pH 7,6) + 0,9% NaCl TdT pufor: 30 mM TRIS + 140 mM Na kakodylát + 1 mM CoCl2; pufor s pH 7,2 TB: 0,3 M NaCI + 0,03 M citrát Na; pH 8,0 Biotín-dUTP: Boehringer 1093 070, pôvodný roztok (50 nM/50 ul) zriedený 1:10 PBS; použitý roztok 5 nM/50 ul (skladovaný po častiach pri -20 ° C) TdT:
Boehringer 220 582, brzlík teľaťa; Originálny roztok (500 U/20 ul) zriedený 1:25 50% glycerolom v PBS; použitý roztok 500 U/500 µl (skladovaný v dávkach pri -20 ° C)
Hovädzí sérový albumín (Roth 8076,2; skladovanie pri 4 ° C)
SABC-KIT: komplex streptavidín-biotín (DAKO K0377; skladovanie pri 4 ° C) DAB: 37,5 mg diaminobenzidínu/150 ml TBS + 70 ul H2O2 30% proteínkinázy; FLUKA 82456; 5, 10, 15, 20, 50 alebo 100 ul/ml TBS DNAsy: 0,5 U/ul (Boehringer Mannheim, 776785) Postup 3 um hrubé parafínové rezy sa naniesli na vhodné mikroskopické podložné sklíčka a namočili sa do nich ako na detekciu proliferácie. Prípravky sa potom bielili v metanole 0,3% peroxidom vodíka (30 minút) a potom sa prepláchli dvakrát destilovanou vodou. Na 35. deň
Na detekciu kaspázy-3 sa použili nasledujúce činidlá: citrátový pufor: 0,01 M; pH 6,0 PBS: fosfátom pufrovaný soľný roztok; bez iónov Ca a Mg; pH 7,4 BSA: hovädzí sérový albumín (ROTH 8076,2; skladovanie pri 4 ° C) NSfS: normálne ovčie sérum (DAKO X0503; skladovanie pri 4 ° C) CNS: kozie normálne sérum (DAKO X0907; skladovanie pri 4 ° C) králiky -Sérum: DAKO X0902; Skladovanie pri 4 ° C DAB: 20 mg diaminobenzidínu/100 ml PBS + 25 ul H2O2, 30%; pH 7,6 Použité protilátky: RahCaspase-3: Serotec AHP476 (protilátka králika proti ľudskej kaspáze-3); 1: 100 v PBS + 2,5% CNS + 0,1% BSA (skladovanie pri 4 ° C) GaR-Ig: DAKO Z0421 (kozie protilátky proti imunoglobulínom králika); 1:20 v PBS + 1% BSA (skladovanie pri 4 ° C) Králik-PAP: DAKO Z113; 1:40 v PBS + 1% BSA (skladovanie pri 4 ° C)
Vyšetrenie svetelným a elektrónovým mikroskopom
Svetelné mikroskopické vyšetrenia sa uskutočňovali pomocou axioskopu zo Zeissu v Nemecku. Pri skúmaní rezov zafarbených HE sa osobitná pozornosť venovala tvaru klkov, priebehu krypty a indikáciám výskytu apoptózy. Rezy zafarbené PAS-AB (pH 2,5) sa hodnotili s ohľadom na distribúciu pohárikových buniek a vyskytujúce sa hodnoty pH mucínu. Pred hodnotením vzoriek, na ktorých sa vykonali špecifické dôkazy (proliferácia a apoptóza), sa najskôr pomocou pozitívnych alebo negatívnych kontrol skontrolovala špecificita metódy. Následne sa osobitná pozornosť venovala výskytu a umiestneniu štruktúr, ktoré sa majú zistiť. Skenovanie pomocou skenovacieho elektrónového mikroskopu sa uskutočňovalo na prístroji od firmy Bausch & Lomb, Kanada, typu Nanolab 2000. Vyhodnocovanie transelektrónových mikroskopických vzoriek sa uskutočňovalo na prístroji EM 10 CR zo Zeissu v Nemecku.
sa nakoniec vyjadrila v počte proliferácií na mm obvodu krypty. Okrem toho sa celkové množstvo aktívne sa deliacich epiteliálnych buniek v určitej časti sliznice vypočítalo vynásobením relatívnej rýchlosti proliferácie zodpovedajúcim faktorom zväčšenia povrchu sliznice spôsobeným tvorbou krypty. Výsledná hodnota vyjadruje, koľko proliferácií je prítomných v kryptovom epiteli do určitej dĺžky sliznice lamina muscularis. Nakoniec sa vypočítal index obnovy epitelu. Na tento účel sa celkové množstvo aktívne sa deliacich epitelových buniek nastavilo vo vzťahu k veľkosti povrchu klkov. Index obnovy naznačuje, koľko nových epiteliálnych buniek vzniká vo vzťahu k povrchu klkov [proliferácia/mm povrch klkov].
Všetky parametre sa stanovili na každom ošípanom a vo všetkých troch častiach čreva. V jednotlivých prípadoch boli odobraté vzorky nepoužiteľné. Priemerná hodnota bola tvorená z hodnôt rovnakého parametra, ktoré boli zaznamenané niekoľkokrát pre každé zviera a každú sekciu. Na zhrnutie šiestich ošípaných v skupine sa tiež určil aritmetický priemer. Porovnania jednotlivých parametrov medzi skupinami sa uskutočňovali pomocou dvojfaktorovej analýzy rozptylu. Hladina významnosti bola 0,05. Kvôli zohľadneniu účinkov podstielky bol faktor „Vrh“ vnorený do faktora „Skupina“. Potom sa uskutočnil Kolmogorov-Smirnov test dobrej zhody so štandardizovanými zvyškami, aby sa overila existencia normálneho rozdelenia. Pre všetky parametre sa dalo predpokladať normálne rozdelenie. S cieľom preskúmať rozdiely v parametroch medzi jednotlivými úsekmi tenkého čreva sa najskôr spriemerovali hodnoty všetkých ošípaných. Potom sa uskutočnil t-test pre spárované vzorky, pričom hladina významnosti bola tiež 0,05. Analýzy sa uskutočňovali pomocou počítačového programu SPSS for Windows, 9.0.1, 1999.