Meranie životnosti v protokole Drosophila melanogaster (preložené do nemčiny)
Zhrnutie
Drosophila melanogaster je výkonný model skúmajúci molekulárny základ regulácie dlhovekosti. Tento protokol pojednáva o krokoch generujúcich reprodukovateľné populačné meranie dĺžky života, ako aj o možných úskaliach a o tom, ako im zabrániť.
Abstrakt
Starnutie je jav, ktorý vedie k stacionárnemu fyziologickému zhoršeniu takmer všetkých organizmov, v ktorých sa študovalo, čo vedie k zníženiu fyzickej výkonnosti a zvýšeniu rizika chorôb. Starnutie jednotlivca sa na úrovni populácie prejavuje zvýšením úmrtnosti súvisiacej s vekom, ktorá sa často meria v laboratóriu sledovaním dĺžky života vo veľkých kohortách ľudí rovnakého veku. Pokusy pokúsiť sa kvantifikovať, do akej miery ovplyvňujú genetické alebo environmentálne manipulácie životnosť jednoduchých modelových organizmov, boli mimoriadne úspešné pri porozumení aspektov starnutia, ktoré sú relevantné pre taxóny, a pri inšpirovaní nových stratégií na predĺženie životnosti a prevenciu chorôb súvisiacich s vekom u cicavcov. sú zachované .
Protokol
Odporúčame skladovať experimentálne potraviny, kvasnicové pasty a misky s hroznovým agarom, ktoré sa objavia v protokole, pri 4 ° C a použiť ich do 1 - 2 mesiacov, pokiaľ nie je stanovený tvar a suchosť. Štandardné podmienky prostredia pre larvy aj pre dospelých zahŕňajú údržbu fázy Letí v inkubátore pri 25 ° C s cyklom svetlo-tma 12:12 h a 60% relatívnou vlhkosťou.
A. Príprava na experimentálne varenie
- Na rast lariev používame modifikované médium Caltech Medium 5, ktoré je v tomto protokole označené skratkou CT.
- Odporúčame stravu pre dospelých Drosophila (SY), ktorá sa skladá z cukru (sacharózy) a kvasiniek (lyofilizované celé pivovarské kvasnice) na 2% agare, ktorý je varený, doplnený antibiotikami a protiplesňovými látkami a dispergovaný (10 ml na injekčnú liekovku) 6. Potraviny by sa mali pred skladovaním nechať stuhnúť a odpariť 12 - 24 hodín. Pretože prostredie živín môže zásadným spôsobom ovplyvniť životnosť, sú metódy konzistentného varenia nevyhnutné tak v rámci experimentu, ako aj pre porovnanie medzi experimentmi.
- Ak sa má do jedla pre dospelých pridať farmakologické činidlo, môže sa tento liek zmiešať v malom množstve jedla a navrstviť (2 ml) na povrch jedla s kontrolnými injekčnými liekovkami obsahujúcimi vrstvy vehikula.
2. Pripravte si živú kvasinkovú pastu
Spojte 5-6 ml vody s 3 g suchého droždia a dobre premiešajte. Konzistencia kvasinkovej pasty musí byť taká, ako pre hladké arašidové maslo.
3. Pripravte si tanier s hroznovým agarom
- Pridajte balenie premixu z hroznového agaru do 500 ml destilovanej vody vo fľaši s objemom 1 000 ml a podľa pokynov na obale rozpustite zmes z hroznového agaru.
- Silnú vrstvu zmesi opatrne nalejte do Petriho misiek s priemerom 100 mm, aby nedošlo k prebublávaniu. Balenie Premixu vyprodukuje asi 14 tanierov hroznového agaru.
- Nechajte médiá vychladnúť a stuhnúť pri izbovej teplote s vekom 15 minút. Dosky je možné skladovať pri 4 ° C, zabaliť do igelitu alebo ihneď použiť.
4. Synchronizovaný zber vajec
Všetky médiá použité v tomto protokole, t. J. Kvasnice, misky s hroznovým agarom, CT a 10% potraviny SY, by mali mať izbovú teplotu.
5. Zbierka vekovo zhodných dospelých mušiek
- Dospelí sa od prvého dňa zvyčajne liahnu od 9 rokov. Zlikvidujte muchy, ktoré sa objavili prvý deň, a vložte fľaše späť do inkubátora na noc. Táto prax zabráni náhodným výberom pre začiatočné situácie a pre zhromaždenie maximálneho počtu synchronizovaných múch.
- O 16-22 hodín neskôr vletí dospelý deň do 10% potravinových fliaš SY. V prípade potreby je možné ďalšiu dávku vyzdvihnúť nasledujúci deň.
- Odletí späť do inkubátora a umožní muchám dosiahnuť pohlavnú dospelosť a páriť sa dva dni. Zapíšte si deň prevodu na 10% fľaše SY ako prvý deň dospelosti.
6. Triedenie múch a nastavenie experimentu dlhovekosti
- Anestetizujte malé skupiny mušiek na anestetickej vložke a potom štetcom roztriedte mužov a ženy do dvoch skupín. Pri použití CO 2 je nevyhnutné minimalizovať vystavenie možným dlhodobým zdravotným problémom, ktoré môžu narušiť integritu experimentu s dlhovekosťou.
- Do jednotlivých injekčných liekoviek vložte 30 mušiek rovnakého pohlavia. Za predpokladu, že v populácii a zdravých potomkoch nebudú žiadne vyrovnávacie chromozómy, by každá fľaša mala produkovať približne 3-4 injekčné liekovky každého pohlavia. Alikvotné množstvo múch do jednotlivých injekčných liekoviek by nemalo presiahnuť 3 - 4 minúty, aby boli muchy po celý čas vystavené anestézii iba po dobu maximálne 9 - 10 minút.
- Opakujte kroky až do 6.1-6.2. Existuje 8 - 10 opakovaní injekčných liekoviek pre každé pohlavie a experimentálna terapia.
7. Nastavte tabuľku programu Excel na sledovanie experimentu s dlhovekosťou
- Odporúčame randomizáciu polohy injekčnej liekovky namiesto zoskupenia injekčných liekoviek podľa experimentálnych podmienok, aby sa zabránilo skresleniu polohy injekčnej liekovky v inkubátore a aby sa zakryla identita injekčnej liekovky s experimentátorom. Za týmto účelom najskôr ku každej injekčnej liekovke v tabuľkovom programe priraďte randomizované číselné ID, potom priraďte liekovky k zásobníkom podľa identifikačného čísla. Ak používate softvér na správu experimentov dLife, podľa pokynov na nastavenie experimentu vygenerujte identifikačné číslo pre každú liekovku.
- (Voliteľné) Ak používate čítačku RFID alebo čítačku čiarových kódov v spolupráci so spoločnosťou dLife, pripojte štítok RFID alebo čiarový kód ku každej injekčnej liekovke a priraďte štítok k ampulke s číselným ID v dLife. Program rozpozná každú liekovku po skenovaní čítačkou a zaháji zaznamenávanie údajov na správne miesto do tabuľky. Použitie čítačky štítkov v spojení s dLife skracuje čas získavania údajov a chyby v zázname.
8. Udržiavanie experimentu dlhovekosti
Injekčné liekovky s čerstvým jedlom by mali mať pri každom prenose izbovú teplotu.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Zjednodušená schéma protokolu je v ilustrácia 1, kde sú načrtnuté dôležité kroky. Synchronizačná časť protokolu môže vyžadovať pre rôzne testy vekovo upravené muchy dospelých.
Typické krivky miery prežitia múch divokého typu sú uvedené v Obrázok 2a zobrazené pomocou softvéru na správu experimentov dLife (Obr. 2b, c). Dospelí muži väčšinou žijú kratšie, obidve populácie dosahujú priemernú a strednú životnosť> 50 dní pri 10% SY potrave pri 25 ° C. Pamätajte, že preživší zostane na začiatku experimentu vysoký a potom exponenciálne klesá.
Životnosť drosophily je ovplyvnená podmienkami prostredia, ako je teplota a strava. Obrázok 3a ukazuje, že dospelí muži zvyčajne žijú podstatne menej so zvýšenou teplotou. Rovnako aj efekt stravovania je celoživotný v 3b darčeky: Dospelé mušky s menej koncentrovanou stravou (5% SY) zvyčajne žijú podstatne dlhšie ako tie, ktoré majú koncentrovanejšiu stravu (15% SY).
Hustota kohort počas vývoja môže ovplyvniť životnosť dospelých a zmeniť načasovanie vývoja. Tu ukážeme príklad toho, ako rôzne hustoty synchronizovaných vajíčok ovplyvňujú vývoj lariev. Ako v 4 zobrazené, dospelá mucha je slabá a povrch potravy je náchylný na sušenie, keď je počet vajíčok príliš nízky. Na druhom konci spektra je vývoj lariev v preplnených bankách oneskorený a výťažok dospelých mušiek je znížený.
Krivka prežitia kohorty ako celku môže byť významne ovplyvnená abnormálnymi účinkami na injekčné liekovky, ako v prípade Obrázok 5 zobrazené. Údaje o nepravidelnom prežití pre jednotlivé injekčné liekovky môžu mať niekoľko príčin, napríklad zlú kvalitu jedla alebo akumuláciu a infekciu baktérií/húb. Aj keď takéto abnormálne úmrtia nemôžu skresliť mieru prežitia populácie, neexistuje jednoduchá metrika na adekvátne stanovenie toho, či by mala byť z experimentu vylúčená liekovka. Týmto situáciám sa preto dá najlepšie vyhnúť dobrou manipuláciou a zmierniť ich použitím veľkej veľkosti vzorky.
Obrázok 2. (A) Reprezentatívne krivky životnosti w 1118 kontrolujúcich dospelých samíc (kruhy) a mužov (štvorce) letí pri 25 ° C na potravine SY10%. (B, C) Reprezentatívne snímky obrazovky softvéru dLife.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
Tu uvedený protokol popisuje metódu na uskutočnenie reprodukovateľných meraní dlhovekosti dospelých jedincov v Drosophile, ktorá je adaptívna na hodnotenie genetických, farmakologických a environmentálnych zásahov. Medzi centrálne aspekty protokolu patrí starostlivá kontrola vývojového prostredia lariev, minimalizácia stresu dospelých a minimalizácia zaujatosti voči experimentálnym skupinám a kontrolám. Predstavujeme tiež použitie softvéru na správu experimentov s doživotnou životnosťou dLife. Jednoduchým pripojením čiarového kódu alebo štítku RFID ku každej nádobe program pomôže pri získavaní údajov dLife pre každé meranie a pri vykreslení krivky miery prežitia. Aj keď je v súčasnosti najvhodnejší na štúdium životnosti muchy pomocou injekčných liekoviek, tento nástroj na správu experimentov by sa dal ľahko prispôsobiť na použitie v iných organizmoch s rôznymi typmi populačných komôr alebo na ďalšie opatrenia vrátane odolnosti proti stresu a prežitia Drogová toxicita.
Medzi dôležité aspekty kontroly prostredia lariev/kukly patrí vyhýbanie sa preplneniu a udržiavanie kontrolovaného prostredia s prísnou reguláciou období svetlo-tma, vlhkosti a teploty. Tieto faktory ovplyvňujú vývoj času a fyzickú kvalitu výsledných dospelých. Nežiaduce larválne prostredie, ako napríklad vysoká hustota lariev, môže viesť k aktivácii stresom indukovateľných faktorov (napr. Expresia proteínu tepelného šoku), o ktorých je známe, že ovplyvňujú životnosť dospelých 18.
Boli navrhnuté alternatívne prístupy k analýze životnosti kŕmenia vrátane prístupu kapilárneho privádzača (metóda CAFE) 23. Táto metóda je pozoruhodná svojou schopnosťou poskytovať presné merania spotreby potravy, vedie však k podstatne kratšiemu počtu muchov 24. Pri hodnotení kombinovaného vzťahu medzi stravou a genetickými faktormi v rámci celkovej dlhovekosti je potrebné použiť možné stresy spojené s prostredím výživy. bude.
Demografická analýza vrátane výpočtu kriviek prežitia a úmrtnosti môže odhaliť veľa informácií o dynamike starnutia populácie. Typická krivka prežitia zostane relatívne skoro na začiatku života a zvýši mieru poklesu u starších žien, čo zodpovedá obdobiu nízkej úmrtnosti, po ktorom nasleduje obdobie exponenciálneho zvyšovania úmrtnosti. Stresujúce prostredie sa zvyčajne prejaví ako prebytok predčasných úmrtí v populácii a abnormálny pokles krivky prežitia. Aj keď takýto výsledok môže poskytnúť významné rozdiely medzi liečbami, pri replikácii zvyčajne nebude robustný. Preto odporúčame, aby sa predtým, ako bude možné dospieť k pevnému záveru, uskutočnili najmenej dva nezávislé (tj. Nepriechodné) replikačné experimenty. Môže byť potrebné vyvinúť ďalšie úsilie na zväčšenie veľkosti vzorky, kontrolu podmienok ustajnenia a zlepšenie zdravia rodičovských rastlín.
Pravicová cenzúra (vyňatie zvierat z experimentu, ktorý je podozrivý z úteku alebo úhyn z náhodných príčin) zvierat, ktoré uhynuli na stresujúce podmienky prostredia, by sa mala vykonávať s mimoriadnou opatrnosťou. Striktne povedané, zariadenie na cenzúru sa musí vyskytnúť náhodne pri experimentálnych liečebných postupoch, a ak experimentálny zásah moduluje citlivosť na stres, bolo by možné neúmyselne aplikovať na populáciu výbery na úrovni liečby. Všeobecne je lepšie vyhnúť sa prítomnosti nejednoznačných faktorov, ktoré môžu spôsobiť predčasné úmrtie (najmä v súvislosti so zdrojom potravy) ako cenzorovacie zariadenie a cenzorovacie zariadenie by sa malo používať iba na organizmy, pri ktorých sa pozoruje smrť alebo únik pri fyzickej manipulácii.
Poslednou úvahou je posúdenie štatistickej významnosti. Zatiaľ čo veľké veľkosti vzoriek kohorty poskytujú pôsobivý výkon pri rozlišovaní malých rozdielov medzi liečbami, musí sa brať do úvahy aj potenciálny biologický význam týchto rozdielov. Pri pomerne veľkých experimentoch na dlhovekosť sú rozdiely často len 2,1% štatisticky vysoko významné, ale celkový vplyv intervencie na zdravotný stav môže byť malý. Pri interpretácii celkových výsledkov experimentu sa preto musí brať do úvahy štatistický aj biologický význam. Záver o procese starnutia z experimentov prežitia je možné doplniť mierami úbytku behaviorálnych alebo fyziologických zdravotných opatrení súvisiacimi s vekom, vrátane lezeckej schopnosti 25 a integrity steny gastrointestinálneho traktu 7.
Záverom možno povedať, že modelový organizmus Drosophila je atraktívnou voľbou pre štúdium mechanizmov starnutia. Vďaka starostlivej experimentálnej technike môže robustná demografická analýza poskytnúť náhľad na účinky farmakologických a genetických faktorov na proces starnutia.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.