Predstavenstvo Prof.

Z lekárskej kliniky pre malé zvieratá, predseda pre vnútorné lekárstvo malých domácich miláčikov a domácich miláčikov, Veterinárna fakulta Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove. Katrin Hartmann Vyrobené pod vedením prof. Dr. Katrin Hartmann Genetické a výživné faktory pri vývoji diabetes mellitus u psov: Štúdie o polymorfizmoch v štyroch kandidátskych génoch a o zásobovaní vitamínom D Úvodná dizertačná práca zameraná na získanie veterinárneho doktorátu z veterinárnej fakulty Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove, ktorú predstavil Jannis Uhrig z Karlsruhe Mníchov 2007

predstavenstvo

Vytlačené so súhlasom Veterinárnej fakulty Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove Dekan: Prednášajúci: Spolurozhodca: Univ.-Prof. DR. E. P. Märtlbauer Univ.-Prof. DR. Hartmann prof. Dr. Goldberg PhD Day: 20. júla 2007

Vieme, vďaka čomu rastú kvety, ale nevieme, prečo máme všetci vedomosti o DNA, ale stále zomierame Justin Sullivan Deklarovanie pochybností ako životnej filozofie je ako voľba zastavenia ako dopravného prostriedku Yann Martel Na pamiatku moja matka

4.5. Meranie hladiny 25 (OH) vitamínu D 3. 61 4.6. Meranie hladiny 1,25 (OH) 2 vitamínu D 3. 62 V. Diskusia. 64 1. Porovnanie metód genotypizácie. 64 2. Etiológia diabetes mellitus u ľudí a psov. 65 2.2 Genetické faktory vzniku diabetes mellitus. 65 2.3 Stav vitamínu D ako výživný faktor pri vývoji cukrovky. 68 3. Obmedzenia tejto štúdie. 69 3.1. Číslo zvieraťa. 70 3.2. Kolektív pacientov. 70 3.3. Kontrolná skupina. 71 3.4. Študovať dizajn. 72 4. Relevantnosť tejto štúdie. 72 5. Výhľad. 73 VI. Zhrnutie. 76 VII. VIII. Zhrnutie. 78 Bibliografia. 80

Abecedný zoznam skratiek 7-DHC: 7-dehydrocholesterol ADA: Americká diabetická asociácia VEK: Pokročilý glykozylovaný konečný produkt ALP: Alanín-aminotransferáza AP: Alkalická fosfatáza APC: Antigén prezentujúce bunky ARMS: Zosilňovač refraktérnych mutácií Systém CTLA4: Cytotoxický T-lymfocyt: Cycle Threshold DDG: German Diabetes Society DKA: Diabetic Ketoacidosis DLA: Dog Leukocyte Antigen D. m .: Diabetes mellitus EDTA: Ethylenediaminetetraoctová kyselina EPI: Exokrinná nedostatočnosť pankreasu GAD65: Glutamát ľudská dekarboxyláza GH: Rastový hormón HGVS: Leukocytový antigén IA-2/ICA-512: tyrozínfosfatáza IBD: zápalové ochorenie čriev ICA: antigén bunkových ostrovčekov IDD: nedostatok inzulínu cukrovka IDDM: inzulín-dependentný diabetes mellitus IFN-y: interferón-y IL-2: interleukín-2 IRD: Diabetes rezistencie na inzulín ISAG: Medzinárodná spoločnosť pre genetiku zvierat LADA: Latentný autoimunitný diabetes u dospelých LYP: Lymfoid-tyrozín-fosfát atáza MHC: hlavný histokompatibilný komplex MODY: Začiatočný diabetes u mladých SM: roztrúsená skleróza

NADPH: redukovaný nikotínamid adenín dinukleotid NIDDM: inzulín-nezávislý diabetes mellitus NO: oxid dusnatý OR: pomer šancí NPH: izofán-inzulín PCR: polymerázová reťazová reakcia PP: pankreatický polypeptid PTH: paratyroidný hormón PZI: protamín-zinok-inzulín RXR: Receptor retinoidu X SD: štandardná odchýlka SNP: polymorfizmus jedného nukleotidu T1DM: diabetes mellitus typu I TBE: TRIS-borát-EDTA TE: TRIS-EDTA TGF-β: transformujúci rastový faktor β TNF-α: faktor nekrózy nádorov-α VDR: vitamín D- Receptor VDRE: Vitamín D reagujúce prvky VIP: Vasoaktívny intestinálny polypeptid VUW: Univerzita veterinárskeho lekárstva, Viedeň WHO: Svetová zdravotnícka organizácia

II. Prehľad literatúry 4 Elektrónový mikroskop je homogénne nepriehľadný, malé granule sú uložené a tvoria asi 5% buniek ostrovčekov. Najmenšia a veľmi heterogénna skupina endokrinných pankreatických buniek, bunky PP, vylučuje hormóny gastroenteropankreatického polypeptidu, napríklad pankreatický polypeptid (PP) alebo vazoaktívny intestinálny polypeptid (VIP). Endokrinné bunky pankreasu sú obklopené hustou sieťou fenestrovaných kapilár a svoje vylučovanie uvoľňujú do krvi exocytózou. Nemožno ich rozlíšiť farbením hematoxylínom-eozínom, ale je možné ich veľmi dobre identifikovať pomocou imunohistochemického farbenia hormónov, ktoré produkujú (MOSIMANN & KOHLER, 1990; SINOWATZ, 2000; BÖCK & LIEBICH, 2004). 1.3. Inzulín Inzulín je peptidový hormón s vynikajúcou homológiou medzi rôznymi druhmi cicavcov. Psí inzulín je svojou sekvenciou identický s prasacím inzulínom (www.ebi.ac.uk/swissprot). Pôsobí prostredníctvom svojho receptora na homeostázu glukózy aj na metabolizmus tukov, bielkovín a ketolátok. 1.3.1. Tvorba inzulínu a sekrécia inzulínu Inzulín sa tvorí ako pre-pro-inzulín v ß-bunkách pankreasu a u psov pozostáva zo 106 aminokyselín, ktoré tvoria signálnu sekvenciu, ako aj z reťazca A a B, ktorý je prepojený medzičlánkom, takzvaným C- Peptid, ktorý sa má spojiť. Odštiepením signálnej sekvencie a vytvorením troch disulfidových mostíkov sa vytvorí proinzulín s 82 aminokyselinami. V ďalšom priebehu procesu sa C-peptid odštiepi a výsledný inzulín, ktorý sa u psov skladá z 51 aminokyselín (SMITH, 1966) naviazaných na ión zinku ako hexamér, sa ukladá v granulách na povrchu bunky a v reakcii na stúpajúcu hladinu cukru v krvi sa Peptid sa vylučuje do krvi v ekvimolárnych množstvách. Pretože tvorba inzulínu z jeho prekurzorov takzvanými prohormón-konvertázami prebieha iba v zásobných granulách, pri rýchlej sekrécii inzulínu sa proinzulín uvoľňuje aj do krvi; má však malú biologickú aktivitu. Ďalej sa do obehu dostanú rôzne bielkoviny z granúl. Väčšine sa pripisuje úloha pri vytváraní optimálnych podmienok skladovania a spracovania inzulínu. Nemožno však vylúčiť, že niektoré z nich môžu vykazovať aj biologickú aktivitu. Jeden

II. Prehľad literatúry 8, ako aj zúženie kapilár v glomerule a sietnici. Táto biochemická reakcia pravdepodobne prispieva k veľkej časti dlhodobého poškodenia D. m. Známeho a obávaného u ľudí, ako je artérioskleróza, diabetická nefropatia a diabetická retinopatia (VLASSARA et al., 1986). Pretože všetky tieto komplikácie sa vyvinú až v priebehu niekoľkých desaťročí, sú pre psa klinicky menej dôležité (FELDMAN & NELSON, 2004). Dlhodobé dôsledky D. m. Relevantné pre psa sú popísané v časti 1.6.3. zaoberal sa. Pri normálnej hladine cukru v krvi sa iba asi 3% glukózy štiepia takzvanou sorbitolovou cestou pomocou enzýmu aldóza reduktáza na sorbitol a nakoniec na fruktózu. V hyperglykemickom stave sa táto hodnota zvyšuje až o 30%. Pretože NADPH (redukovaný nikotínamidadeníndinukleotid) sa spotrebuje pri štiepení glukózy polyinozitolovou cestou, v bunke sa vyskytuje nedostatok NADPH. NADPH je substrát pre glutatiónperoxidázu, ktorý chráni bunku pred voľnými radikálmi, a tým pred poškodením spôsobeným oxidačným stresom. Týmto spôsobom by zvýšená aktivita aldózreduktázy, o ktorej sa predpokladá, že sa podieľa aj na tvorbe AGE, mohla prispieť k poškodeniu vaskulárneho endotelu, a tým k vyššie uvedeným komplikáciám D. m. U ľudí (SRIVASTAVA et. al., 2005). Zdá sa, že tieto mechanizmy majú tiež malý význam u psov D. m. Vzhľadom na krátku životnosť psa, ale zdá sa, že dráha sorbitolu hrá dôležitú úlohu pri formovaní diabetického katarakty u psov aj u ľudí (LIGHTMAN, 1993; WILKIE a kol., 2006). 1.5. Epidemiológia psieho cukrovky Podľa americkej štúdie, ktorá retrospektívne porovnávala distribúciu plemien psov s D. m. S distribúciou plemien psov prezentovanou na tej istej klinike z iných dôvodov v priebehu rokov 1970-1999 malo dvanásť plemien obzvlášť vysoké riziko vzniku D. m. (austrálsky teriér, stredný bradáč, Samoyede, miniatúrny knírač, foxteriér, keeshond, bichon frise, finnenspitz, cairn teriér, miniatúrny pudel, sibírsky husky, pudl s hračkami). Väčšina psov mala v čase stanovenia diagnózy päť až desať rokov, čo je najvyššia prevalencia D. m. Vo vekovej skupine medzi jedenástimi a 15 rokmi (GUPTILL et al., 2003).

II. Prehľad literatúry 10 1993). Hyperlipidémia je laboratórny nález, ktorý sa dá často pozorovať, pretože sa v prípade nedostatku inzulínu v dôsledku zvýšenej lipolýzy v krvi hromadí viac voľných mastných kyselín. Hyperlipidémia vedie k zvýšenému ukladaniu tukov v pečeni, a tým k hepatálnej lipidóze (JAMES & DAY, 1999). To vedie k zvýšeniu aktivity pečeňových enzýmov alkalickej fosfatázy (AP) a alanínaminotransferázy (ALT). V štúdii s 208 psami s D. m. 90% všetkých psov preukázalo zvýšenie aktivity AP a 78% zvýšenie aktivity ALT, u 42% psov bolo sérum lipemické (HESS et al., 2000). . 1.6.2. Základné choroby Hormonálne vplyvy, liečba a choroby pankreasu a iných orgánov môžu viesť k vzniku D. m. V zásade platí, že D. m. Na základe inzulínovej rezistencie je reverzibilný a v prípadoch hyperadrenokorticizmu alebo zvýšenej potreby inzulínu v dieste môže včasná liečba základného ochorenia alebo okamžitá kastrácia niekedy viesť k prechodu z prechodného stavu na trvale sa prejavujúci D. .m. je potrebné sa vyhnúť. Vo väčšine prípadov však už príliš veľa β-buniek zahynulo kvôli toxicite glukózy alebo vyčerpaniu ich sekrečnej kapacity, aby sa udržala dostatočná sekrécia inzulínu, takže reverzibilný inzulín rezistentný D. m. Sa stane ireverzibilným diabetom s nedostatkom inzulínu (FELDMAN & NELSON, 2004; NORMAN a kol., 2006). 1.6.2.1 Akútna a chronická pankreatitída Akútna alebo chronická pankreatitída sú bežné choroby, ktoré vedú k deštrukcii endokrinných buniek pankreasu a tým k nedostatku sekrécie inzulínu; neoplazmy exokrinného pankreasu sa vyskytujú zriedka (ALEJANDRO et al., 1988). Akútna pankreatitída má tendenciu viesť k rýchlej deštrukcii β-buniek, a teda k nedostatočnej sekrécii inzulínu, zatiaľ čo chronická pankreatitída je najdôležitejším dôvodom zápalu spojeného s inzulínovou rezistenciou (FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.2.2. Hyperadrenokorticizmus Glukokortikoidy, ktoré produkuje organizmus alebo sú dodávané iatrogénne, vedú k zvýšeniu hladiny cukru v krvi prostredníctvom zvýšenej glykogenolýzy a glukoneogenézy. Pôsobia ako antagonisti inzulínu a môžu viesť k D. m. Ďalej glukokortikoidy vedú k a

II. Prehľad literatúry 14 mikroalbuminúria existuje zvýšená produkcia transformačného rastového faktora β (TGF-β). Tento rastový faktor je zodpovedný za zvýšené extracelulárne ukladanie proteínov matrice v glomerule; to vedie k zhrubnutiu bazálnej membrány a rozšíreniu mezangia (SCHENA & GESUALDO, 2005). Pretože trvanie počiatočnej fázy je približne päť rokov a diabetická nefropatia sa úplne rozvinie až po približne 20 rokoch, vyskytuje sa len veľmi zriedka kvôli kratšej životnosti domácich psov (STRIPPOLI et al., 2003; FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.3.6. Diabetická ketoacidóza DKA je život ohrozujúce vykoľajenie metabolizmu tela v dôsledku neošetrenej alebo zle nastavenej hodnoty D. m., Charakterizované biochemickou triádou hyperglykémie, acidózy a ketózy. Ako už bolo opísané, nedostatok inzulínu a glukózy v periférnych bunkách tela vedie k zvýšenej lipolýze a tvorbe ketolátok v pečeni, pretože voľné mastné kyseliny sa oxidujú na acetyl-CoA, ktorý sa nepridáva do cyklu kyseliny citrónovej z dôvodu nedostatku glukózy v bunke. môže a je metabolizovaný na slabé kyseliny acetón, acetoacetát a β-hydroxybutyrát. Tento účinok je zosilnený zvýšenými koncentráciami inzulínových antagonistických hormónov (najmä glukagónu a glukokortikoidov) a zvýšená glukoneogenéza a glykogenolýza vedú k ďalšiemu zvýšeniu hladiny cukru v krvi. To vedie k osmotickej diuréze, strate elektrolytov a dehydratácii (SONKSEN & SONKSEN, 2000; GOODMAN, 2003). Ketónové telieska môžu byť použité mnohými bunkami tela, vrátane buniek v mozgu, na výrobu energie, ale ak sú tvorené v nadmernom množstve, prispievajú k vážnemu vykoľajeniu metabolizmu tela. Pôsobia ako slabé kyseliny, a preto vedú k vyčerpaniu tlmivých systémov v krvi, a tým k metabolickej acidóze. Voľne sa filtrujú cez glomerulum a kvôli svojej hydrofilnosti zosilňujú osmotickú diurézu. Kvôli negatívnemu náboju ketolátok sa z krvi do moču vylučujú katióny ako sodík a draslík, ale tiež vápnik a horčík, aby sa zachovala elektroneutralita krvi. To vedie k vyčerpaniu sodíka a draslíka v tele a k ďalšej, závažnej dehydratácii. Ak nedochádza k prítoku glukózy do buniek tela, nemôže do bunky vstupovať žiadny draslík, pretože je to možné pomocou

III. Material & Methods 40 alebo boli praktickými lekármi odoslaní na kliniku, až keď nastanú komplikácie. 1.1.3. Rasa a distribúcia pohlavia 13 psov bolo zmiešaných plemien; najčastejšie zastúpenými rodokmeňovými psami boli jazvečíky, west highlandskí bieli teriéri a pudli (každý po štyroch pacientoch) a nemeckí ovčiaci psi (traja pacienti, pozri tabuľku 2). Najčastejšie boli zastúpené plemená malých teriérov (West Highland White Terrier, Yorkshire Terrier, Jack Russel Terrier ako aj Welsh Terrier a Scotch Terrier s celkovým počtom desiatich pacientov). Plemená psov z Lekárskej kliniky malých zvierat v Mníchove sú uvedené osobitne v tab. 3, aby bolo možné ich počas sledovaného obdobia porovnávať s najbežnejšími plemenami celej populácie pacientov lekárskej kliniky malých zvierat. 28 psov s D. m. Boli fenky, z toho 15 kastrovaných a 13 nekastrovaných, 23 psov s D. m. Boli muži, jedenásť z nich kastrovaných a dvanásť nekastrovaných. Tab. 2: Najčastejšie plemená psov s diabetes mellitus (celá študovaná populácia) Plemeno Počet Zmiešané plemeno 13 Jazvečík 4 Pudel 4 West Highland White Terrier 4 Rotvajler 3 Nemecký ovčiak 3 Yorkshirský teriér 2 Jack Russel Teriér 2 Ostatné 16

III. Materiály a metódy 50 amplifikátu. Pretože väzbová účinnosť primérov bola odlišná, hodnoty Ct sa líšili napriek rovnakému množstvu DNA v rôznych alelách, a preto by sa Ct1C) mala líšiť v ich teplote topenia. Optimálna teplota žíhania a koncentrácia alelovo špecifického priméru musia byť optimalizované v niekoľkých predbežných testoch (LINDBLAD-TOH et al., 2005). Fungujúci prístup by sa mohol ustanoviť iba pre jeden z SNP; primery a reakčné podmienky sú uvedené v tab. PCR sa uskutočňovala na 96-jamkových doštičkách (Thermowell Gold PCR Plates, Corning Inc., Corning, USA) s termálnym cyklérom AB 7300 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Po PCR nasledoval krok disociácie, v ktorom sa stanovila teplota topenia produktov PCR pomocou teplotného gradientu (60 - 95 ° C). Buď negatívny prvý derivát fluorescenčnej krivky vykazoval vrchol pri nižšej teplote topenia, potom sa amplifikoval kratší amplikón a vzorka obsahovala adenín alebo tymín v mieste SNP, alebo sa vyskytoval vrchol s vyššou teplotou, potom bola vzorka homozygotná pre guanín alebo cytozín. Heterozygotné zvieratá vykazovali dva vrcholy, po jednom vrchole pri zodpovedajúcej teplote. Priméry sa získali od spoločnosti Operon Biotechnologies GmbH v Kolíne nad Rýnom v Nemecku. Použil sa Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, USA). Aby bolo možné porovnať túto novú metódu genotypizácie s ARMS-PCR, bol SNP V7 genotypovaný pomocou obidvoch metód.

III. Materiály a metódy 55 Tab. 9 SNP V7 Meltingcurve-PCR; Primér, program PCR, reakčná zmes, vytlačené tučným písmom: Výmena báza Primer 1 (špecifický pre alelu) GCGGGCAGGGCGGCCCTGGCTAGCCCTGAC Primer 2 (špecifický pre alelu) GCGGGCCCTGGCTAGCCCTGAT spoločný primer AGTCAGGTGCCCTCCTCCTTTGG Spustenie cyklu 95 60 s syntéza 72 C 30 s šarža H20 7,8 ul (20 ul) primer 1 (10 μm) 0,4 ul primer 2 (5 μm) 0,4 ul bežný primer (10 μm) 0,4 ul 2x SYBR-Green Mastermix 10 ul DNA-templátu 1 ul 2.8. Štatistika Štatistické vyhodnotenie sa uskutočnilo pomocou SPSS pre Windows, verzia 13.01 (SPSS Inc., Chicago, USA). Nepárový Studentov t-test sa použil na porovnanie stredných hodnôt vitamínu D a test χ 2 na porovnanie frekvencií alel. Za významné sa považovalo p 0,05. Analýza sily testu a požadovaného počtu zvierat sa uskutočnila pomocou programu Power And Precision (Biostat Inc., Englewood, USA).

IV. Výsledky 56 IV. Výsledky 1. Sekvenovanie Vytvorili sa páry primérov pre celkom 18 rezov génov VDR, CTLA4, LYP-PNP a DLA, rezy sa amplifikovali pomocou PCR a purifikovaná replikovaná DNA sa sekvenovala. Páry primérov sa vybrali tak, aby sa amplifikovalo čo najviac častí všetkých exónov a hraníc exónu a intrónu. 1.1. Sekvenovanie génu pre receptor vitamínu D Keď sa porovnávali sekvenované génové segmenty, v géne VDR sa našlo sedem SNP, tri z nich v intrónoch, tri v exónoch a jeden v nepreloženej oblasti 5 (obr. 1). Obrázok 1: Polymorfizmy jedného nukleotidu (šípky) v géne pre receptor vitamínu D (kódujúce oblasti (exóny) zobrazené šedými políčkami) 1.2. Sekvenovanie génu pre cytotoxický antigén T lymfocytov 4 V géne CTLA4 sa našli dva SNP, jeden v exóne 2 a jeden v exóne 4 (obrázok 2). Obrázok 2: Polymorfizmy jedného nukleotidu (šípky) v géne pre cytotoxický antigén T lymfocytov 4 (kódujúce oblasti (exóny) zobrazené šedými políčkami).

IV. Výsledky 57 1.3. Sekvenovanie génu pre lymfoidnú tyrozínfosfatázu V géne LYP sa našiel SNP, ktorý sa nachádzal v exóne 13 a viedol k zámene aminokyselín (fenylalanín> leucín). Obrázok 3: Jednonukleotidové polymorfizmy (šípky) v géne pre lymfoidnú tyrozínfosfatázu (kódujúce oblasti (exóny) zobrazené šedými políčkami) Všetky SNP s presným umiestnením a pomenovaním podľa nomenklatúry Spoločnosti pre variabilitu ľudského genómu (HGVS) sú uvedené v tab. 10. Tab. 10 Lokalizácia jednonukleotidových polymorfizmov (SNP) (UTR = neprekladaná oblasť, AS-Aust. = Výmena aminokyselín, PPA = test primérov-sond, ARMS = Amplicon Mutation Refractory System-PCR, TM = Meltingcurve-PCR, Phe = fenylalanín., Leu = leucín) Gén oblasti SNP AS-Aust. PCR V1 c.-21t> c 5 'UTR VDR - PPA V7 c.501 + 3310A> G Intron 3 VDR - ARMS/TM V8 c.501 + 3434c> t Intron 3 VDR - ARMS V9 c.533c> t Exon 4 VDR - sekvenované V10 c.677t> c exón 5 VDR - ARMS V11 c.761t> c exon 5 VDR - ARMS V13 c.1150 + 1580a> g intron 7 VDR - ARMS C1 c.372c> t exon 2 CTLA4 - PPA C2 asi 958a> g exón 4 CTLA4 - ARMS LYP c.2344a> t exón 13 LYP-PNP Phe> Leu PPA