Protokol dvojrozmernej gélovej elektroforézy (preložený do nemčiny)
Prehľad
Dvojrozmerná gélová elektroforéza (2DGE) je technika, ktorá dokáže vyriešiť zo zmesi tisíce biomolekúl. Táto technika zahŕňa dve rôzne separačné metódy spojené dohromady: izoelektrická fokusácia (IEF) a elektroforéza na géli s polyakrylamidom dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Toto fyzicky oddeľuje zlúčeniny cez dve osi gélu podľa ich izoelektrických bodov (elektrochemická vlastnosť) a ich molekulových hmotností.
Postup v tomto videu pokrýva kľúčové koncepty 2DGE a všeobecný postup charakterizácie zloženia komplexného proteínového roztoku. Tri príklady tejto techniky sú uvedené pod hlavičkou aplikácií, vrátane detekcie biomarkerov na iniciáciu a progresiu ochorenia, kontrolnej liečby u pacientov a štúdia proteínov po posttranslačnej modifikácii (PTM).
Dvojrozmerná alebo 2D gélová elektroforéza je technika, ktorá pomocou dvoch rôznych separačných metód dokáže oddeliť tisíce proteínov z jednej zmesi. Jedna z techník, SDS-PAGE alebo elektroforéza na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným, sama o sebe úplne neoddeľuje komplexné zmesi látok. 2D gélová elektroforéza spáruje SDS-PAGE s druhou metódou, izoelektrickou fokusáciou alebo IEF, ktorá sa separuje v izoelektrických bodoch, čo umožňuje lyzovať roztok potenciálne všetkých proteínov v bunke. Toto video demonštruje princípy 2D gélovej elektroforézy, všeobecný postup a niektoré z jeho biomedicínskych aplikácií.
2D gélová elektroforéza začína IEF ako prvou dimenziou. Každý proteín má pH, ktoré sa nazýva izoelektrický bod alebo pI, kde je čistý náboj nulový. Keď je proteín vystavený elektrickému poľu, pohybuje sa smerom k elektróde s opačným nábojom. Vzorky, ktoré sú predmetom záujmu, sú imobilizované gradienty pH alebo IPG, prúžky naplnené amfolytmi, ktoré majú zakopané molekuly s kyslými a zásaditými skupinami. Na pásik s gradientom pH sa potom aplikuje elektrické pole, ktoré spôsobí, že proteíny migrujú, kým nedosiahnu hodnotu pH na úrovni svojej pI, kde stratia čistý náboj.
Pred spustením druhej dimenzie sa vložené proteíny ošetria SDS, denaturujú a poskytujú jednotný negatívny náboj. Po dokončení sa prúžky IPG umiestnia na polyakrylamidový gél. Aplikované elektrické pole priťahuje proteíny smerom k anóde, pričom väčšie proteíny sa pomaly pohybujú cez gél.
Len čo sa proteínová zmes rozdelí podľa pl a molekulovej hmotnosti, vizualizuje sa mapa proteómu so škvrnami a identifikujú sa požadované proteíny.
Teraz, keď sme diskutovali o princípoch 2D gélovej elektroforézy, prejdime k typickému laboratórnemu postupu.
Pred uskutočnením experimentu musia byť proteíny solubilizované v médiu. Solubilizácia vzorky sa uskutočňuje de-agregáciou proteínov kombináciou chaotropných látok na prerušenie interakcií vodíkových väzieb, neiónových detergentov, zabránenia zmeny náboja proteínov, redukčných látok, rozbitia disulfidových väzieb a pufrov. Aby sa odstránili rušivé bohaté proteíny a iné molekuly, materiál sa postupne extrahuje centrifugáciou a zberom z výslednej pelety; nasledovalo ošetrenie endonukleázou, enzýmom použitým tak, aby nekonzumovala DNA, ktorá by interferovala s experimentom.
Po rozpustení proteínov sa prúžky IPG pripravia tak, že sa opláchnu čistiacim roztokom prúžkov a nechajú sa zaschnúť obrátene. Každému prúžku je potom priradené číslo držiteľa prúžku. Po dokončení je pásik zaťažený pomalým kĺzavým pohybom z negatívneho na pozitívny pól bunkového extraktu. Na účely rehydratácie sa vlhký blotovací papier umiestni na elektródu a pod gélové prúžky; prúžky IPG sa potom lemujú na prístroj IEF. Aplikuje sa vysoký elektrický prúd a proteíny začnú migrovať.
Po dokončení prvého rozmeru je gél pripravený na SDS-PAGE v nalievacom zariadení. Pásy IPG sa ošetria vložením do ekvilibračného pufra obsahujúceho SDS. Elektroforetická jednotka sa pripraví pridaním elektroforetického tlmivého roztoku. Ošetrené prúžky IPG sa zhromaždia kliešťami, umiestnia sa na gélové platne a utesnia sa agarózovým tesniacim roztokom. Zdroj napätia potom aplikuje elektrické pole, ktoré sa udržiava, kým najrýchlejšie sa pohybujúce proteíny nenachádzajú 1 cm nad dnom gélu.
Po dokončení elektroforézy musia byť proteíny vizualizované. Tradične sa to robí farbením pomocou Coomassie modrej alebo dusičnanu strieborného. Požadované proteíny sa prenesú z gélu analýzou Western blot a analyzujú sa.
Druhý prístup k identifikácii zahŕňa excíziu proteínov z gélu a ich trávenie pri analýze hmotnostnou spektrometriou.
Teraz, keď sme preskúmali jednu metódu, zvážme niektoré z použití pre 2D gélovú elektroforézu.
Jedným z najbežnejších použití tejto techniky je identifikácia molekúl podieľajúcich sa na iniciácii a progresii ochorenia. 2D gélová elektroforéza spojená s hmotnostnou spektrometriou rozpoznáva reguláciu nahor alebo nadol špecifických proteínov v chorých oblastiach v porovnaní so zdravými.
Okrem toho je 2D gélová elektroforéza užitočná po pokroku pacienta v reakcii na potenciálne terapeutické liečivo. Vzorky môžu byť pacientom odobraté v rôznych časoch po liečbe. Týmto spôsobom môže 2D gélová elektroforéza spojená s analýzou Western blot alebo hmotnostnou spektrometriou zistiť proteíny spojené s negatívnymi reakciami, ako je zápal; alebo nedostatok bielkovín v temperovanom stave.
Ďalšou oblasťou použitia pre 2D gélovú elektroforézu je štúdium proteínovej štruktúry a funkcie po posttranslačnej modifikácii alebo PTM, čo sú doplnky proteínov, ktoré sú po ich translácii z mRNA. PTM môže vykonávať rôzne funkcie vrátane proteínovej signalizácie, regulácie génovej expresie alebo spôsobovania oxidačného poškodenia. 2D gélová elektroforéza je citlivá na zmeny, ako je metylácia alebo acetylácia, ktoré môžu spôsobiť posun v pI a molekulovej hmotnosti.
Práve ste sledovali video od JoVE na 2D gélovej elektroforéze. Toto video popisuje princípy techniky, typický experimentálny postup a niektoré z jej aplikácií v biomedicínskej oblasti.