Veľkoplošná rekonštrukcia defektov pomocou nového hybridného rámu z poly

predmetov

abstraktné

úvod

Poruchy kostí kritickej veľkosti sú bežnou klinickou poruchou, obvykle spôsobenou traumou, ochorením kostí alebo resekciou nádoru 1. Výsledný úbytok kostnej hmoty sa nedá fyziologicky napraviť a zvyčajne je potrebné veľké množstvo kostnej regenerácie 2. Kostné štepy, ako sú autotransplantáty a aloštepy, sa často používajú na indukciu a zväčšenie kostí pri veľkých kostných defektoch3. Tieto kostné štepy však majú určité obmedzenia, vďaka ktorým sú náhrady syntetických kostných štepov atraktívnou alternatívou 4, 5 .

Výsledky

Charakterizácia rámcov PLLA/nHA/CM-AL

Morfológia a pórovitosť kostry

Morfologické vlastnosti lešení boli vizualizované svetelnou mikroskopiou a SEM, ako je znázornené na obr. Prierezová analýza rámcov pod svetelnou mikroskopiou ukázala, že fotové zóny a CH/nHA-AL (hnedý) boli v rámcoch rovnomerne rozložené (obr. 1A). Pod SEM vykazovali rámce homogénne spojenú pórovitú štruktúru s priemermi pórov 150 - 250 μm. Morfológia lešení bola medzi dvoma lešeniami (PLLA/nHA a CM-AL) veľmi odlišná, pričom CH/nHA-AL boli čiastočne zabudované do lešení CM-AL (1A).

rekonštrukcia

Vlastnosti rámcov CM-AL obsahujúcich rôzne koncentrácie CH/nHA-AL. ( A. ) Morfológia rámcov CM-AL (0%), CM-AL (10%) a CM-AL (20%) pod svetelnou mikroskopiou (LM) a skenovacou elektrónovou mikroskopiou (SEM); ( B. ) Pórovitosť rámcov CM-AL s rôznym obsahom CH/nHA-AL; ( C. ) Pevnosť v tlaku a modul pružnosti rámov CM-AL s rôznym obsahom CM-AL; ( D. ) In vitro testovanie uvoľňovania liečiva z lešení CM-AL po dobu až 25 dní s použitím lešení CH/nHA-AL a PLLA/nHA/AL ako kontroly. Čierna šípka označuje PLLA/nHA matricu, zatiaľ čo biela šípka označuje CH/nHA-AL mikrosféry. * str

veľkoplošná

In vitro degradácia rámcov CM-AL s rôznymi obsahmi CH/nHA-AL počas 12-týždňového pozorovania. ( A. ) Morfologické zmeny na lešení pozorované pri SEM; ( B. ) hodnota pH degradačného média pripraveného lešenia so zvyšujúcou sa inkubačnou dobou; ( C. ) Strata hmotnosti lešenia počas demontáže. Biela šípka označuje mikrosféry CH/nHA-AL. * str

veľkoplošná

Cytokompatibilita skeletov CM-AL in vitro. ( A. ) Bunková morfológia a adhézia králičích ASC na lešení pod SEM; ( B. ) Analýza cytotoxicity ASC prežila v vylúhovaní lešenia pomocou testu MTT; ( C. ) Aktivita alkalických fosfátov (ALP) ASC v vylúhovacej tekutine lešenia; ( D. ) Syntéza mineralizovanej matrice sa analyzovala na depozíciu vápnika farbením alizarínovou červenou. Biela šípka označuje mikrosféry CH/nHA-AL. * p # str

rekonštrukcia

Röntgenová analýza regenerácie kostí v rôznych časoch po implantácii. ( A. ) Reprezentatívne rádiografy regenerácie kostí v rôznych časoch. V kontrolnej skupine došlo k novej tvorbe kostí, ale kostný defekt sa neopravil; V skupine s autotransplantátom autológny ortotopický štep umožňoval úplné liečenie defektov polomeru počas 8-týždňového sledovania; V skupine implantátov CM-AL (0%) bola v 8. týždni zjavná tvorba nových kostí. Línie zlomenín kostí boli ťažko pozorovateľné, zatiaľ čo nebolo zistené žiadne zosieťovanie dutín kostnej drene. V skupine s implantovaným CM-AL (10%) sa kostné defekty liečili tvorbou nových kostí počas 4 až 8 týždňov. ( B. Semikvantitatívna analýza ukázala významnú novotvorbu kostí v skupine s implantovaným CM-AL (10%) v porovnaní s skupinou s implantovaným CM-AL (0%) a údaje časom pribúdali. * str

veľkoplošná

Histologická analýza regenerácie kostí a degradácie lešenia v rôznych časoch po implantácii. ( A. ) HE farbenie ukazujúce malé množstvo novovytvorených trabekúl po 2 týždňoch v skupinách CM-AL (0%) aj CM-AL (10%). V týždňoch 4 a 8 sa predstavili hrubé kostné trámce a zoskupili sa s jasne viditeľnou vaskulárnou štruktúrou. Porucha naplnená vláknitým tkanivom bola stále viditeľná v skupine CM-AL (0%), zatiaľ čo bola menej viditeľná v skupine CM-AL (10%). ( B. ) Kvantitatívna analýza ukázala nárast novej oblasti kostí so začlenenými CM-AL a nárast dní. Biele šípky označujú oblasti novej tvorby kostí, zatiaľ čo čierne šípky označujú kostru (zväčšenie: × 40). * str

rekonštrukcia

Massonovo farbenie ukázalo postupné dozrievanie novo vytvorenej kosti v oboch skupinách. Novo vytvorená kosť bola zafarbená silno modro (ako ukazuje biela šípka) v 2. týždni a modrá oblasť sa postupne zmenšovala, keď kosť dozrievala v 8. týždni, čo naznačuje, že osteogenéza začala u oboch skupín už v 2. týždni proces osteogenézy však trval dlhšie v skupine s CM-AL (10%) ako v skupine s CM-AL (0%) (zväčšenie: × 40).

diskusia

In vitro degradačný test ukázal zvýšenú degradáciu CM-AL skeletov so zvýšeným obsahom CH/nHA-AL a medzi CM-AL skeletmi (10%) a kontrolou PLLA/nHA nebol významný rozdiel v degradácii. Kolísanie pH počas in vitro degradácie poréznych CM-AL skeletov bolo menšie ako variácií PLLA/nHA skeletov, čo naznačuje degradáciu PLLA matrice aj CM. Medzitým sa významne zvýšil pomer úbytku hmotnosti na lešení CM-AL, zatiaľ čo mechanické vlastnosti boli výrazne nižšie. Tieto výsledky boli v súlade s predchádzajúcou štúdiou, ktorá naznačovala, že úbytok hmotnosti kompozitov na báze PLLA sa zvyšoval so zvýšeným dávkovaním CMs, čo sa pripisovalo prednostnému rozpusteniu chitosanovej zložky v kompozitoch 41. Predpokladá sa, že rýchla degradácia zavedených CM prispieva k úbytku hmotnosti lešení v počiatočnej fáze 37. Celkovo naše výsledky preukázali, že lešenia PLLA/nHA s 10% CH/nHA-AL vykazovali preferenčné vlastnosti, zatiaľ čo zvyšovanie obsahu CH/nHA-AL na 20% spôsobilo nepriaznivý účinok. Preto sa v ďalších štúdiách použili skelety PLLA/nHA s 10% CH/nHA-AL.

Táto štúdia má však aj určité obmedzenia. Kolorimetria molybdénovej modrej sa primárne používala na stanovenie koncentrácie AL na základe fosfátového aniónu vo vode. Aj keď sa metóda ukázala ako reprodukovateľná, presná a vhodná na stanovenie AL 33, 48. Namiesto PBS sa však použila destilovaná voda, ktorá simuluje konštantné pH telesnej tekutiny, pretože veľké množstvo fosfátu z PBS môže interferovať s určením AL. Preto v našej budúcej práci môžu byť pre stanovenie AL zvážené ďalšie metódy, ktoré môžu lepšie simulovať stav telesnej tekutiny.

Záverom možno povedať, že AL sférické mikroguličky CH/nHA boli úspešne zabudované do lešení na báze PLLA/nHA a bol vyvinutý systém dodávania na báze mikroguličiek pre dodávku AL a inžinierstvo kostného tkaniva. Lešenie CM-AL (10%) vykazovalo trvalejšie uvoľňovanie liečiva a porovnateľné mechanické a degradačné vlastnosti. Osteogénna diferenciácia ASC sa tiež zvýšila, čo dokazuje významne zvýšená aktivita ALP a depozícia vápnika. Štúdie in vivo preukázali vynikajúce hojenie kostí CM-AL (10%) skeletov, porovnateľné s hojením autotransplantátov. Výsledky tejto štúdie preto naznačujú sľubné použitie lešení CM-AL (10%) na dodávanie liečiv a na inžinierstvo kostného tkaniva.

materiál a metódy

Výroba PLLA

PLLA sa pripravili polymerizáciou laktidu za otvorenia kruhu. Stručne povedané, monomér L-laktidu (90%, Jiangxi Wuzangye Biochemical Industry Co., Ltd., Šanghaj, Čína) bol dehydratovaný pri teplote 140 až 150 ° C počas 4 až 5 hodín, po čom nasledovala dekompresná dehydratácia pri teplote 2,5 až 8,0 kPa a 170 ° C počas 6 - 8 hodín. Produkty sa depolymerizovali na laktid v prítomnosti oktoátu cínatého (0,27 kPa, 37 ° C). Laktid sa prečistil opakovanou rekryštalizáciou z etylacetátu ako rozpúšťadla. Polymerizácia pri otváraní kruhu sa uskutočňovala za vzniku PLLA v prítomnosti laktidu a oktoátu cínu ako iniciátora a katalyzátora (8000: 1). Kopolymér PLLA bol charakterizovaný gélovou permeačnou chromatografiou (GPC) a infračervenou spektroskopiou s Fourierovou transformáciou, ako už bolo opísané 49.

Výroba poréznych rámov CM-AL

rekonštrukcia

Schematické znázornenie výroby skeletov PLLA/nHA/CM-AL na regeneráciu kostí u králičieho modelu s veľkými segmentovými defektmi kostí.

Charakterizácia rámcov PLLA/nHA/CM-AL

Vlastnosti morfológie a pórovitosti

Morfológia skeletov PLLA/nHA/CM-AL bola vizualizovaná svetelnou mikroskopiou (Olympus U-RFL-T, Tokio, Japonsko) a skenovacím elektrónovým mikroskopom (SEM, Nova NanoSEM230, USA). Pórovitosť lešení sa merala podľa Archimedovho princípu, ako bolo opísané vyššie 51. Stručne povedané, rámce sa umiestnili do odmerného valca, ktorý bol naplnený určitým množstvom etanolu (VI). Zaznamenal sa celkový objem po ponorení do lešenia (V2) a objem etanolu, ktorý zostal vo valci (V3) po odstránení lešenia. Pórovitosť sa potom stanovila pomocou nasledujúcej rovnice:

Mechanické vlastnosti

Boli vyrobené rámce s dĺžkou 20 ± 0,7 mm a šírkou 7 ± 0,5 mm a sušené vo vákuu po dobu 24 hodín. Mechanické vlastnosti sa merali pomocou univerzálneho mechanického testovacieho stroja Instron 1121 pri izbovej teplote s rýchlosťou zaťaženia 1,0 mm/min a mechanickou deformáciou 2 mm. Modul kompresie sa vypočítal pomocou dynamického modulu pružnosti testera DTM-II (Xiangyi Instruments Co., Ltd., Xiangyi, Čína). Pre každú vzorku boli testované tri vzorky.

Dodávanie liekov in vitro

Uvoľňovanie liečiva in vitro sa meralo podľa našej predchádzajúcej metódy s niektorými modifikáciami 33. Stručne, každý skelet bol vložený do dialýzneho vaku ponoreného do destilovanej vody (40 ml) a pretrepávaný po dobu 25 dní pri 37 ° C a rýchlosti 45 ot./min. Supernatant (2 ml) sa zachytával každý deň a kvantifikoval sa kolorimetrickým stanovením molybdénovou modrou.

In vitro degradácia

Vzorky obdĺžnikového lešenia sa ponorili do fosfátového tlmivého roztoku (PBS) a sledovali sa kolísaním pH a pomerom straty hmotnosti. PH sa meralo raz týždenne počas 16 týždňov. Strata hmotnosti lešení bola zaznamenávaná každé 4 týždne po vákuovom sušení počas demontáže. Z každého lešenia boli vyrobené tri vzorky pre každý časový bod.

Test biokompatibility in vitro

Test morfológie buniek a adhézie

Lešenie sa kultivovalo spolu s kmeňovými bunkami odvodenými z králičieho tuku (ASCs, Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, Čína) na účely morfológie buniek a testu adhézie. Lešenie bolo nakrájané na malé kúsky (7 mm x 7 mm x 1 mm) a sterilizované pomocou nízkoteplotnej plazmovej sterilizácie. ASC (1 x 104 buniek/ml, 100 ul) sa naočkovali na skelety a inkubovali sa 2 hodiny v inkubátore pri 37 ° C, aby sa umožnilo pripojenie buniek. Potom sa pridali 2 ml média Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) doplnené 10% fetálnym hovädzím sérom, aby sa udržala hydratácia. V 2. a 5. deň kultivácie boli skeletové bunky naočkované bunkami odstránené a opatrne trikrát premyté PBS. Bunky na skeletoch sa potom imobilizovali 4% formaldehydom a oxidom osmičelým počas 15-30 minút pri teplote 4 ° C a opatrne sa trikrát premyli PBS. Vzorky sa potom postupne dehydratovali vždy dvakrát po dobu 10 minút sériou etanolu (50, 70, 90, 95 a 100%). Vzorky sa nechali v kritickom bode vysušiť a potiahli zlatom na SEM analýzu bunkovej morfológie a adhézie.

Test cytotoxicity in vitro

100 mg štvorcové lešenárske doštičky (14 doštičiek, 7 mm x 7 mm x 1 mm/doštička) boli sterilizované a ponorené do 20 ml média pri 4 ° C na 48 hodín. Králičie ASC (5 x 104 buniek/ml, 100 ul) sa naočkovali na 96-jamkové doštičky a kultivovali sa v inkubátore pri 37 ° C po dobu 48 hodín, potom sa médium obnovilo. Roztok MTT (1 mg/ml, 100 ul, Sigma-Aldrich) sa pridal do každej jamky v 1., 3. a 5. deň a inkuboval sa 4 hodiny pri 37 ° C. Po odstránení supernatantov sa 150 p.l. Na rozpustenie modrých kryštálov formazanu sa pridal 1 dimetylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich). Absorbancia sa merala pri 490 nm čítačkou ELISA (Bio-Tek Instruments, Inc., Highland Park, VT, USA).

Osteogénna diferenciácia in vitro

Osteogénny účinok skeletu PLLA/nHA/CM-AL in vitro sa analyzoval stanovením aktivity alkalickej fosfatázy (ALP) a farbením alizarínovou červenou. Králičie ASC (5 x 104 buniek/ml, 120 ul/jamku) sa nasadili na 12jamkovú doštičku obsahujúcu extrahované tekutiny z lešení s alebo bez osteogénneho média (OGM, DMEM, 10% FBS), 100 nmol/l dexametazónu). 0,05 mmol/l kyselina askorbová a 10 mmol/l & b; -Glycerofosfát). Aktivita ALP sa merala 7. a 14. deň, ako sa už opísalo 31. deň. Na zafarbenie alizarínovou červenou sa médium menilo každé 3 dni. Bunky sa získali 7. a 14. deň a fixovali sa v 4% formaldehyde počas 15 minút. Po dvojnásobnom premytí PBS sa na vzorky pôsobilo 25 minút alizarínovou červenou (0,5 ml, 40 mmol/l, pH = 4,1). Obrázky boli potom urobené pod inverzným optickým mikroskopom (Nikon, Tokio, Japonsko). Percentá pozitívnych buniek sa vypočítali z najmenej 3 náhodne vybraných polí.

In vivo regenerácia kostí

Štatistická analýza

Údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Pokusy sa uskutočňovali trikrát. Štatistické porovnania sa uskutočňovali podľa potreby Studentovým t-testom alebo jednosmernou analýzou variancie (ANOVA). Hodnoty P menšie ako 0,05 sa považovali za štatisticky významné.

vďakyvzdania

Túto prácu podporila Čínska národná prírodovedná nadácia (grant č. 81371934, č. 81501860 a č. 31470948) a bola čiastočne financovaná Čínskou štipendijnou radou (grant č. 201506370173).

Poznámky

Odoslaním komentára vyjadrujete súhlas s našimi podmienkami používania a pokynmi pre komunitu. Ak zistíte, že niečo zneužíva alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte to ako nevhodné.