Vplyv tkanivových makrofágov na metabolické choroby - PDF na stiahnutie zadarmo
1 Vplyv tkanivových makrofágov na metabolické choroby MASTEROVÁ PRÁCA pre získanie akademického titulu Master of Science na Hamburskej univerzite aplikovaných vied Fakulta biologických vied Katedra biotechnológie Prof. Dr. Oliver Ullrich Dr. Andre Broermann predložila: Christiane Dickel Utorok, 13. novembra 2012
2 Hamburg University of Applied Sciences Fakulta biologických vied Katedra biotechnológie Lohbrügger Kirchstrasse Hamburg v spolupráci s: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Birkendorfer Strasse Biberach an der Riss Autor: Christiane Dickel Termín odovzdania: Prvý skúšajúci: Druhý skúšajúci: Prof. Dr. Oliver Ullrich Dr. Andre Broermann
3 Obsah 1. Úvod. VI 1.1 Obezita a inzulínová rezistencia. VI 1.2 Evolučná perspektíva. VIII 1.3 Makrofágy pri metabolických ochoreniach. X podtypov makrofágov. X Transendoteliálna migrácia makrofágov. XIII Úloha CCR2 a MCP-1 pri nábore makrofágov. XIII 1.4 Markery bielych krviniek pre FACS analýzu. XV 1,5 zvieracích modelov. XVI Myš ob/ob. XVI Myš db/db. XVII DIO myš. XVII 1.6 Možnosti liečby cukrovky typu II. XVIII 1.7 Cieľ. XXII 2. Materiály a metódy. XXIII 2.1 Materiály. XXIII Spotrebný materiál. XXIII Použité zariadenie. XXIII chemikálie. XXIV protilátky. XXVI kŕmne zmesi pre zvieratá. XXVI 2.2 Metódy. XXVII tkanivový prípravok. Izolácia buniek XXVII. Počet buniek XXVII. XXVII imunofluorescenčné farbenie. XXVIII Analýza fluorescenciou aktivovaného triediča buniek (FACS). XXIX III
4 2.2.6 Hodnotenie. Test tolerancie na inzulín (ITT). XXXI Test tolerancie na orálnu glukózu (ogtt). Stanovenie cytokínov XXXII. XXXII zvieratá. Štatistika XXXIII. XXXIII 3. Výsledky. XXXIV 3.1 Stanovenie stratégie spracovania myšacieho, nadsemenného tukového tkaniva pre FACS analýzu bankomatov. XXXIV 3.2 Stanovenie metódy FACS pre kvantitatívnu analýzu leukocytov. Tandemový panel XXXV (panel pre 4 osoby). XXXV analýzy s 3-násobným zafarbením. Kombinovaný panel XXXVI (panel 4). Test systému XLI 3.3. XLIV leukocyty v genetickom modeli cukrovky. Porovnanie metódy XLIV. Analýza XLIV s 3 panelmi. Analýza XLVII s kombinovaným panelom. Porovnanie výsledkov LI. LII leukocyty v modeli cukrovky vyvolanej stravou. LIII 3.4 Subchronická štúdia antagonistu CCR2 u myší huccr2. LVI leukocyty. Koncentrácia MCP-1 v krvnej plazme LVI. LXII metabolické parametre. LXIII 4. Diskusia. LXV 4.1 Vytvorenie FACS analýzy na kvantifikáciu celkových a prozápalových makrofágov v myšom tukovom tkanive. Tandemový panel LXV. Kombinovaný panel LXV. Trojité farbenie LXV. Panel LXVI M1/M2. LXVI IV
5 4.2 Porovnanie metód. Genetické modely myší LXVII 4.3. LXVIII 4.4 Model diéty vyvolanej obezity (DIO). LXX 4.5 Porovnanie modelov obezity. LXXI 4,6 Zvýšené počty ATM u obéznych myší. LXXII 4.7 CCR2 antagonizmus ako terapeutická možnosť pre diabetes typu II. Čísla ATM LXXIII pred liečbou látkou. LXXIII Protizápalový účinok pioglitazónu v modeli DIO. Antagonizmus LXXIV CCR2 bez protizápalového účinku na tukové tkanivo semenníkov. LXXIV Vzťah medzi zápalom tukového tkaniva a metabolickými parametrami v tomto experimente. LXXV 5. Výhľad. LXXVI 6. Zhrnutie. LXXVII 7. Zoznam skratiek. LXXVIII 8. Zoznam obrázkov. LXXXI 9. Zoznam tabuliek. LXXXIV 10. Bibliografia. LXXXV 11. Príloha. LXXXIX 11.1 Údajové listy pre kŕmne zmesi. LXXXIX údajový list krmiva na farme. Údajový list LXXXIX stravy s vysokým obsahom tukov. Karta s údajmi XC o bežnej strave. Protokol XCI 11.2 FACS protokolu Dr. Chavakis na TU Drážďany. XCII čestné vyhlásenie. XCVII ďakujem. XCVIII V
9 1. Úvod Obrázok 2: Vývoj tukového tkaniva, pečene a hematopoetického systému v jednotlivých orgánoch u cicavcov V Drosophila melanogaster sa tukové tkanivo, pečeň a hematopoetický systém kombinujú do funkčnej jednotky nazývanej tukové telo. Tento pôvod vývoja sa odráža v podobnej štruktúre cicavčích homológov. Účinky adipocytov v tukovom tkanive a hepatocytov v pečeni na zodpovedajúce imunitné bunky, makrofágy a Kupfferove bunky sú veľmi podobné. Okrem toho existuje úzke spojenie medzi odpoveďami imunitného systému a metabolického systému, čo sa prejaví v priamom prístupe týchto dvoch tkanív k sieti krvných ciev. (Hotamisligil, 2006) 9
10 1. Úvod 1.3 Makrofágy pri metabolických ochoreniach Subtypy makrofágov V roku 2003 bola po prvýkrát publikovaná súvislosť medzi inzulínovou rezistenciou súvisiacou s obezitou a chronickým zápalom v tukovom tkanive, ktorá bola vyjadrená vo forme akumulácie makrofágov v bielom tukovom tkanive (Weisberg et al., 2003; Xu a kol., 2003). Makrofágy sú diferencované monocyty, ktoré sa vyvíjajú z prekurzorových buniek miechy. Patria teda k cirkulujúcim bielym krvinkám. Monocyty aj makrofágy sú heterogénne bunkové populácie. Pôvodne boli definované dva podtypy makrofágov: klasicky aktivované prozápalové makrofágy M1 a alternatívne aktivované makrofágy M2 (Gutierrez et al., 2009; Schipper et al., 2010). U cicavcov s normálnou hmotnosťou sa leukocyty nachádzajú v tukovom tkanive, pečeni, svaloch a pankrease. Ich fenotyp zodpovedá fenotypu M2 makrofágov, ktoré sa podieľajú na homeostáze tkanív (Lumeng a kol., 2007c; Lumeng a kol., 2008; Odegaard a kol., 2008; Olefsky & Glass, 2010; Lumeng a kol., 2007b). Pritom vylučujú protizápalové cytokíny, ako je interleukín (IL) -10, IL-4 a IL-13 (obr. 3). 10
11 1. Úvod Obrázok 3: Polarizácia makrofágov pri inzulínovej rezistencii vyvolanej obezitou v tukovom tkanive Za normálnych váhových podmienok vylučujú adipocyty faktory, ako je interleukín (IL) -13, ktorý indukuje alternatívnu aktiváciu makrofágov. Alternatívne aktivované (M2) makrofágy vylučujú protizápalové mediátory, ako je IL-10. Tieto protizápalové cytokíny majú pozitívny vplyv na citlivosť na inzulín. Obezita vyvoláva zmeny v metabolizme adipocytov a v génovej expresii cytokínov. To vedie k zvýšenej lipolýze a uvoľňovaniu prozápalových voľných mastných kyselín (ffas) a k faktorom, ktoré hromadia a aktivujú makrofágy. Takými faktormi sú monocytový chemotaktický proteín-1 (MCP-1) a faktor nekrózy nádorov a (TNFa). Klasicky aktivované makrofágy M1 produkujú veľké množstvo prozápalových mediátorov, ako sú TNFa, IL-lp a rezistín, ktoré pôsobia na adipocyty a tým indukujú inzulínovú rezistenciu. Týmto spôsobom sa vytvára samovoľný začarovaný kruh, ktorý ďalej zvyšuje zápal a inzulínovú rezistenciu. (Olefsky & Glass, 2010; obrázok 2, s. 223) 11
23 2. Materiály a metódy 2. Materiály a metódy 2.1 Materiály Spotrebný materiál Popis Výrobca # Číslo produktu. Rukavice Nitril Kimberly-Clark # 90627 Mikroreakčné skúmavky eppendorf # Skúmavky Safe Lock (0,5, 1,5, 2,0 ml) eppendorf # eppendorf # Pipetovacie špičky eppendorf # (20, 200, 1000, 5 000 µl) eppendorf # eppendorf # eppendorf # Matičné pipetovacie špičky Thermo Scientific # 7281 Jednorazové pipety costar reagenčný zásobník VWR # Centrifugačná skúmavka (15, 50 ml) greiner # 188271, ml skúmavky BD Falcon # jamka s hlbokým guľatým dnom BD Falcon # Petriho misky BD Falcon # Jednorazové komory na počítanie buniek invitrogén # 10283 Tyčinky na meranie cukru v krvi Smart Swing # 21 Gluko Zellstrayner Fisherbrand # Použité zariadenia Označenie Názov produktu Výrobca Analytická váha AC211S Váha Sartorius A30 Inkubátor Mettler BBD 6220 Heraeus naklápacia trepačka PTR-30 Grant-bio Chladená odstredivka Heraeus Megafuge 40R Thermo Scientific pipety 2, 10, 20, 100, 200, 1000, 5000 µl eppendorf
24 2. Materiály a metódy Maticové pipety 1250 Matrix Impact 2 Thermo Scientific pipetovacia pomôcka accu-jet Bezpečnostné skrinky BRAND Safe Thermo Scientific stolní centrifuga 5417C eppendorf Počítadlo buniek Vortexer VF2 Janke & Kunkel Počítadlo buniek Počítadlo invitrogén Fluorescenciou aktivovaný triedič buniek MACS Quant Miltenyi Biotech glukometr AGM-4000 MSD Smart Swing Cobas Integra 400 plus Roche chemikálie názov Bacillol plus Výrobca # Číslo produktu BODE RPMI 1640 with Glutamine Lonza # 4464 Fetal Bovine Serum Biological Industries # 04-001AUS-1A Dulbecco s Phophate Buffered Saline Lonza # 6716 Collagenase Sigma # C0130 Trypan blue invitrogen # T10282 Running Buffer MACS Buffer # Storage Solution MACS Buffer # Solution Washing MACS Buffer # Solution Washing MACS Buffer # Bieliaci roztok MACS Pufr # chlorid amónny EDTA Sgima AG Sigma #EG hydrogenuhličitan draselný chlorid sodný MERCK # chlorid draselný MERCK # hydrogénfosforečnan sodný MERCK # síran horečnatý MERCK #
25 2. Materiály a metódy Chlorid vápenatý Sigma #CG Dihydrogenfosforečnan draselný MERCK # Hepes Fluka # 54466 Hydrogenuhličitan sodný MERCK # Glukóza Sigma-Aldrich # 15 896–8 Antagonista pioglitazónu CCR2 Takeda interne vyrábaný hemolýzny tlmivý roztok 150COCOCO 4 Cl 250 µm EDTA 10 mm KH: Roztok 1 (4-násobný) 137 mm NaCl 5,36 mm KCl 0,34 mm Na2HPO4 0,81 mm MgSO4 1,26 mm CaCl2 0,44 mm KH2HPO4 Roztok 2 (4-násobný) 10 mm Hepes 4,17 mm NaHC03, 1 diel každého z roztokov 1 a 2, sa zmieša s 2 dielmi dvakrát destilovanej vody a pH sa nastaví na 7,3 pomocou NaOH pri teplote roztoku 4 ° C. 25
26 2. Materiály a metódy Protilátky Označenie Výrobca # Produkt č. PE potkan proti myšiam CD45 BD Pharmingen # PE potkan IgG2b, κ izotypová kontrola BD Pharmingen # APC potkan anti-myš CD11b BD Pharmingen # APC potkan IgG2b, κ izotypová kontrola BD Pharmingen # PE-Cy 7 škrečok anti-myš CD11c BD Pharmingen # PE-Cy 7 škrečok IgG1, λ1 kontrola izotypov BD Pharmingen # PE škrečok anti-myš CD11c BD Pharmingen # PE škrečok IgG1, λ1 izotypová kontrola BD Pharmingen # FITC škrečok anti-myš CD11c BD Pharmingen # FITC škrečok IgG1, λ1 kontrola izotypov BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Krysa Anti-Mouse CD45 BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Krysa IgG2b, κ Izotypová kontrola BD Pharmingen # Krysa Anti-Mouse F4/80 Antigén: FITC Krysa IgG2b Negatívna kontrola: FITC AbDserotec # MCA497FB abdserotec # MCA1125FT FC Blok Krysa Anti - Myš CD16/CD32 BD Pharmingen # Kŕmne zmesi pre zvieratá Udržiavanie krmiva Kliba Nafag #% kcal strava s vysokým obsahom tukov Výskumné diéty # D% kcal Kontrolná strava Výskumné diéty # D12450B Zodpovedajúce údajové listy pre kŕmne zmesi nájdete v prílohe (časť 11.1). 26
31 2. Materiály a metódy Výpočet koncentrácie bankomatov v tukovom tkanive: Výpočet percenta makrofágov v SVF: Test tolerancie na inzulín (ITT) Test tolerancie na inzulín (ITT) sa tiež nazýva test na hypoglykémiu inzulínu a používa sa na detekciu inzulínovej rezistencie. Po injekcii inzulínu nastáva u zdravého organizmu výrazné zníženie koncentrácie cukru v krvi. Ak existuje inzulínová rezistencia, pokles glukózy v krvi v reakcii na podanie inzulínu sa zníži. Zvieratá sa nechali hladovať dve hodiny pred začiatkom experimentu. Po týchto dvoch hodinách, bezprostredne pred aplikáciou inzulínu, sa zaznamená hodnota nalačno. Inzulínový roztok sa zvieratám podáva i.p. (napr. 0,5 IU/kg). V časoch 10, 20 a 120 minút po podaní inzulínu sa zmerala hladina cukru v krvi zvierat pomocou prúžkov na meranie hladiny cukru v krvi a meracieho prístroja od spoločnosti Gluko Smart Swing. To sa deje pomocou kapilárnej krvi zo špičky chvosta. 31
33 2. Materiály a metódy Zvieratá Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali v súlade s usmerneniami regionálnej rady v Tübingene. Myši boli umiestnené v prostredí bez patogénov za štandardného svetelného cyklu (12 hodín svetlo/tma) s voľným prístupom k vode a potrave. Zvieratá boli objednané od Janviera. V tomto projekte bola na vyvolanie inzulínovej rezistencie použitá strava s vysokým obsahom tukov. Za týmto účelom dostali myši C57BL/6J stravu D12451 (20% kcal proteín, 35% kcal sacharidy, 45% kcal tuk) a zodpovedajúcu kontrolnú stravu D12450B (20% kcal proteín, 70% kcal sacharidy, 10% kcal tuk) z výskumných diét. s rovnakým množstvom kcal v celkovom príjme Štatistika Štatistická analýza sa uskutočňovala pomocou softvéru Prism verzia 5.0 pre Windows od spoločnosti Graphpad. Na porovnanie dvoch skupín sa použil t-test. Pre skupinovú analýzu s viac ako dvoma skupinami sa analýza uskutočňovala pomocou ANOVA a Dunnettovho testu. Hodnoty P 0,05 sa považovali za významné. Významnosť bola označená takto: * zodpovedá p 0,05, ** zodpovedá p 0,01 a *** zodpovedá p 0,
37 3. Výsledky A B C Obrázok 8: Izotypová kontrola makrofágového panelu s potkaním IgG2bK-pe, potkaním IgG2b-FITC a potkaním IgG2bK-apc A V bodovom blote SSC proti FSC je definovaná brána P1 (červená), ktorá ukazuje SVF. Signály B PE a FITC z tejto brány P1 sa ďalej analyzujú v bodovom blote. Výrazná populácia, ktorá je pozitívna pre obe označenia, je označená ako CD45 + F4/80 + (zelená). C Tieto dvojité pozitívne bunky sú vynesené proti svojmu APC signálu do histogramu a pozitívny signál (ružový) zobrazuje trojité pozitívne makrofágy SVF. Je definovaná špecifická populácia buniek CD45 + F4/80 + (obrázok 7B). Dvojito pozitívne bunky sa skúmajú v APC kanáli na špecifický pozitívny signál CDllb (obrázok 7C). Tieto trojité pozitívne bunky sú makrofágy. Zodpovedajúca izotypová kontrola ukazuje, ako sa očakávalo, len veľmi nízky nešpecifický signál pre bodový prenos PE/FITC (obrázok 8B) aj pre histogram APC (obrázok 8C). 37
39 3. Výsledky ABCD Obrázok 10: Izotypová kontrola prozápalového makrofágového panelu s potkaními IgG2b κ-PE, potkaními IgG2b κ-apc a škrečkami IgG1 λ1-fitc A V dot blot SSC proti FSC je definovaná brána P1 (červená), čo je SVF mapy. B PE signál tejto brány P1 sa ďalej analyzuje v bodovom blote. CD45 pozitívne bunky (modré) sa uzavrú bránou a C sa zobrazí na histograme proti ich APC signálu. Pozitívny signál (ružový) sa potom hradlí D vzhľadom na signál FITC. Týmto spôsobom je možné analyzovať trojité pozitívne prozápalové makrofágy SVF (zelené). PE signál anti-cd45 protilátky ukazuje dva mračná bodov, ktoré možno zreteľne od seba rozlíšiť (obr. 9B). Na histograme APC možno vidieť aj dva jasne definované vrcholy (obr. 9C). V izotypovej kontrole nie sú žiadne nešpecifické väzby ani v jednom kanáli (obrázky 10B a 10C). Avšak dvojité pozitívne bunky vykazujú vysoký šum pozadia pre fluorescenčnú emisiu v kanáli FITC (obrázok 9D). Cez nastavenú bránu však možno vylúčiť všetky nešpecifické signály (obr. 10D). 39
41 3. Výsledky Bunky F4/80 + CDllb + tvoria zreteľnú bunkovú populáciu v diagrame FITC/APC (obr. 11 B). Tieto dvojité pozitívne makrofágy tiež tvoria negatívny a pozitívny signál v PE histograme (obrázok 11C). Ako v bráne makrofágov, tak aj v gated bunkách CD11c + sú určené na izotypovú kontrolu bez signálu (obr. 12B a 12C). Kombinovaný panel (panel so 4) Pretože analýza štyroch bunkových markerov v paneli protilátok má veľké výhody, ako je nižšia spotreba protilátok a kratší čas ako pri použití analýza dvojitého trojnásobného zafarbenia makrofágového a prozápalového makrofágového panelu znamená, že panel s F4/80-FITC, CD11b-APC a CD11c-PE bol rozšírený o anti-CD45 protilátku so značkou Alexa Fluor 700. Obrázok 13 zobrazuje emisné spektrum štyroch použitých štítkov. Kombinácia týchto fluórchrómov by mala byť možná, pretože emisné spektrá sa nepresahujú vo svojich maximách. Obrázok 13: Fluorescenčné spektrá kombinovaného panelu (panel so 4) s FITC, PE, APC a Alexa Fluor700 41
42 3. Výsledky Výsledná hradlová štruktúra pre analýzu makrofágov a prozápalových makrofágov je uvedená nižšie (obr. 14). Zodpovedajúce izotypové riadenie je možné vidieť na obr. A B C D Obrázok 14: Brány štvorcestného protilátkového panelu s CD45-Alexa700, F4/80-FITC, CD11b-APC a CD11c-PE A V bodovom blote SSC proti FSC je definovaná brána P1 (červená), ktorá predstavuje SVF. B Signály Alexa Fluor700 a FITC z tejto brány P1 sa ďalej analyzujú v bodovom blote. Výrazná populácia, ktorá je pozitívna pre obidve značky, je označená ako CD45 + F4/80 + (modrá). Tieto dvojité pozitívne bunky sú v histograme vynesené proti svojmu APC signálu v C a pozitívny signál (ružový) predstavuje trojité pozitívne makrofágy SVF. Tieto makrofágy sú vyšetrené na ich PE signál v ďalšom histograme. CD11c pozitívne prozápalové makrofágy SVF bránené zelenou bránou môžu priamo súvisieť s makrofágmi SVF tej istej vzorky pri jednom meraní. 42