Výskyt a detekcia citrinínu v potravinách rastlinného pôvodu - PDF zadarmo

Z vedeckého centra Weihenstephan Science for Nutrition, Land Use and Environment Technickej univerzity v Mníchove, predseda organizácie Animal Hygiene Univ. - Prof. Dr. DR. h.c. Johann Bauer Predložil predseda Inštitútu pre hygienu a technológiu potravín živočíšneho pôvodu Predseda pre hygienu a technológiu mlieka Univ. - Prof. Dr. Veterinárna fakulta Erwina Märtlbauera na Univerzite Ludwiga Maximiliána v Mníchove Výskyt a detekcia citrinínu v potravinách rastlinného pôvodu Úvodná dizertačná práca na získanie veterinárneho doktorátu veterinárnej fakulty Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove Claudia Barbara Schneider z Mníchova Mníchov 2007

citrinínu

Vytlačené so súhlasom Veterinárnej fakulty Ludwig-Maximilians-Universität München Dekan: Rečník: Spolurozhodca: Univ.-Prof. DR. E. P. Märtlbauer prof. Dr. Märtlbauer, jún, prof. Dr. Deň absolvovania Deeg: 9. februára 2007

Môj manžel a moje dve dcéry

Strana I Obsah Úvod. 1 B literatúra. 3 1 Fyzikálne a chemické vlastnosti citrinínu. 3 2 Huby produkujúce citrinín. 5 3 Výskyt citrinínu. 7 4 Toxikokinetika. 9 5 Biologické vlastnosti citrinínu. 10 5.1 Účinky na mikroorganizmy. 10 5.2 Účinky na makroorganizmy a bunkové systémy. 5.2.1 Cytotoxicita. 5.2.2 Nefrotoxicita. 5.2.3 Genotoxicita. 15 5.2.4 Karcinogenita. 16 5.2.5 Embryotoxické a teratogénne účinky. 17 5.2.6 Kombinované účinky s inými mykotoxínmi. 17 5.3 Farmakologické vlastnosti. 18 6 Metóda detekcie citrinínu. 19 C Materiál a metódy. 20 1 materiál. 20 1.1 Ukážkový materiál. 20 1.2 Spotrebný materiál. 21 1.3 Spotrebný materiál. 21 1.4 Chemikálie. 22 2 metódy. 22 2.1 Vývoj metódy na stanovenie citrinínu v obilninách. 23 2.1.1 Predbežné testy na extrakciu. 23 2.1.2 Predbežné testy na čistenie. 24 2.1.2.1 Separácia kvapalina-kvapalina. 2.1.2.2 Čistenie extrakciou na pevnej fáze. 30 2.1.2.3 Čistenie pomocou imunoafinitnej chromatografie. 33 2.2 Vývoj metód na stanovenie citrinínu v ovocných a zeleninových šťavách. 34

Strana II 2.3 Orientačné štúdie na stabilitu citrinínu v ovocných šťavách 38 2.4 Stanovenie citrinínu v ázijských potravinách. 38 2.5 Validácia metód. 39 2.6 Hmotnostné spektrometrické stanovenie citrinínu. 41 2.6.1 LC-MS analýza obilnín. 41 2.6.2 LC-MS/MS analýza ovocných a zeleninových štiav a ázijských potravín. 42 2.7 Preskúmanie komerčných vzoriek. 43 D výsledkov. 45 1 Detekcia a stanovenie citrinínu pomocou ESI-MS alebo MS/MS. 45 2 predbežné experimenty na stanovenie citrinínu v organických matriciach. 48 2.1 Obilniny. 48 2.1.1 Ťažba. 48 2.1.2 Čistenie. 49 2.1.2.1 Separácia kvapalina-kvapalina. 49 2.1.2.2 Čistenie pomocou extrakcie na pevnej fáze. 52 2.1.2.3 Čistenie pomocou imunoafinitných kolón. 54 2.2 Ovocné a zeleninové šťavy. 55 2.2.1 Výsledky predbežných skúšok. 55 2.2.2 Predbežné štúdie o stabilite citrinínu v jablkovej šťave. 57 2.3 Validácia metódy. 58 3 Výskyt citrinínu v potravinách. 61 3.1 Obilniny. 61 3.2 Ovocné a zeleninové šťavy. 62 3.3 Ázijské jedlá. 62 E diskusia. 63 F zhrnutie. Zhrnutie 68 G. 69 H Bibliografia. 70

Strana III Zoznam obrázkov: Obrázok 1: Štruktúrny vzorec citrinínu, A) forma p-chinónu a B) forma o-chinónu. 3 Obrázok 2: LC-MS chromatogramy (m/z 251) štandardného roztoku (5 ng/ml) (vyššie) a vzorka kukuričnej múčky obsahujúcej citrinín (4,4 ug/kg, nižšie). 46 Obrázok 3: Hmotnostné spektrum citrinínu (ESI +, napätie kužeľa 30 V). 46 Obrázok 4: LC-MS/MS chromatogramy (m/z 249/175) štandardného roztoku (1 ng/ml vyššie) a vzorky jablkovej šťavy umelo kontaminovanej citrinínom (c: 0,1 ng/ml nižšie). 47 Obrázok 5: Degradačné správanie citrinínu v jablkovej šťave pri izbovej teplote. 58

Strana VI Zoznam skratiek aw hodnota aktivita vody BEN Balcan Endemická nefropatia Bunky BHK21 Bunky obličiek Babyhamstera Bunky CHO-K1 Bunky vaječníkov čínskeho škrečka DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNS: Deoxaribonukleová kyselina) EIA Enzýmová imunotest (enzýmová imunotest) g gravitačné zrýchlenie (1g = 9,81 m/s 2) g gramov HCl kyseliny chlorovodíkovej Hela bunky Ľudské bunky karcinómu krčka maternice HEK293 bunky Ľudské embryonálne bunky obličiek HL-60 bunky Ľudské promyelocytové leukemické bunky HPLC Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia HPRT Hypoxantín-guanín-fosforibozyl-transferáza HTC-bunky Hepatómové tkanivové bunky IAC Imunoafinitná chromatografia IARC Medzinárodná agentúra pre výskum rakoviny im intramuskulárne i.p. intraperitoneálne i.v. intravenózne kg kilogram telesnej hmotnosti LC-MS kvapalinová chromatografia - hmotnostná spektrometria LC-MS/MS kvapalinová chromatografia - tandemová hmotnostná spektrometria LD letaldóza LLC-PK1 bravčová obličková bunková línia MDBK bunky Madin Darby hovädzie obličkové bunky MeOH metanol min minúty ml mililitre mm milimolárne MPN Mykotoxická prasačia nefropatia m-rns posol ribonukleová kyselina m/z hmotnosť/náboj n počet NADH nikotínamid adenín dinukleotid N 2 dusík nm nanomolárny ng nanogram nn nedetegovateľný PBS fosfátový pufrovaný soľný roztok p.o. na os

Strana VII ppb častice na miliardu ppm častice na milión RNS ribonukleová kyselina r-rns ribozomálna ribonukleová kyselina RP RNS ribonukleová kyselina v reverznej fáze s.c. subkutánny test SCE test výmeny sesterských chromatidov TBME terciárny butyl-metyl-éter TLC chromatografia na tenkej vrstve UDS test neplánovaná syntéza DNA (DNA repair

Literatúra strana 6 Tabuľka 2: Huby produkujúce citrinín z rodu Aspergillus Penicilium Monascus (Cole a Cox, 1981; Betina, 1989, Roth a kol., 1990; Frank, 1992; Blanc a kol., 1995b, Wang a kol., 2005). Druh A. candidus A. flavipes A. niveus A. terreus P. canescens P. citroviridae P. citrinum P. claviforme P. expansum P. Fallutanum P. implicatum P. janthinellum P. jenseni P. lividum P. palitans P. purpurrescens P. . roqueforti P. spinolosum P. velutinum P. verrucosum M. floridanus M. lunisporas M. pallens M. pilosus M. purpureus M. ruber M. sangiuneus

Literatúra strana 19 6 Metódy detekcie citrinínu V porovnaní s inými mykotoxínmi je len málo údajov o výskyte citrinínu v potravinách. Je to čiastočne kvôli jeho analytickým zvláštnostiam, pri ktorých sa môže javiť ako problematická nestabilita toxínu počas prípravy vzorky a silne kolísajúca miera výťažnosti (Wilson, 1994), ako aj výrazné chvosty pri chromatografickej detekcii (Dick, 1988). Doteraz sa detekcia citrinínu uskutočňovala hlavne pomocou chromatografie na tenkej vrstve (TLC) (Blanc et al., 1995a, b, Martins et al., 2002, Gimeno, 1984), vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) s UV (Phillips et al., 1980) alebo fluorescenčnej detekcie ( Lepom, 1986, Reinhard a Zimmerli, 1999b, Schneweis a kol., 2001) a plynovou chromatografiou (GC) (Shu & Lin, 2002). a enzýmové imunotesty (EIA) (Abramson a kol., 1996, 1999, Dietrich a kol., 1998, 1999, Vrabcheva a kol., 2000, Schmid, 2002).

Materiál a metódy strana 20 C Materiál a metódy 1 Materiál 1.1 Materiál vzorky V tejto práci sme skúmali hlavne obilie a výrobky z obilia ako aj ovocné a zeleninové šťavy. Okrem toho sa analyzovali jednotlivé ázijské jedlá. Vzorky boli získané od maloobchodníkov s potravinami. Cereálie Celkom 380 vzoriek sa analyzovalo na prítomnosť citrinínu. Z toho 279 bolo obilia/výrobkov z obilia a 69 bolo kukurice/výrobkov z kukurice. Ďalej bolo vyšetrených 19 pohánkových/pohánkových výrobkov a 13 vzoriek ryže. Ovocné a zeleninové šťavy Z 98 analyzovaných štiav bolo 34 jablkových, 27 pomarančových, 7 hroznových, 8 ananásových, 4 hruškových, 7 banánových, 3 broskyňových, 4 multivitamínových, 3 paradajkových a 1 mandarínkovej. Ázijské jedlo 2 vzorky vína saké a 2 omáčky hoi-sin, ako aj ázijská koreninová pasta boli vyšetrené na prítomnosť citrinínu. Na vývoj a validáciu detekčných metód bol použitý mykologicky neškodný materiál vzorky. Umelá kontaminácia materiálu vzorky sa uskutočňovala štandardnými roztokmi citrinínu.