Behaviorálne farmakologické a molekulárno-biologické štúdie na odbúravaní opiátov u potkanov -

Behaviorálne farmakologické a molekulárno-biologické štúdie na odbúravaní opiátov u potkanov Dizertačnú prácu Biologickej fakulty Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove Zoologický ústav Katedra neurobiológie prezentoval Dipl.-Biol. Christian Kirschke 31. októbra 2001

behaviorálne

Prvá správa: Druhá správa: Špeciálna správa: Prof. Dr. Rainer Landgraf prof. Dr. Peter Schlegel prof. Dr. Deň ústnej skúšky Rainera Spanagela: 17. júna 2002

Obsah 1. Všeobecný úvod 3 2.1. Úvod [S 35] - autorádiografická štúdia - GTPγS 11 2.2. Materiál a metódy [S 35] -GTPγS autorádiografická štúdia 17 2.2.1. Zvieratá a chov zvierat 17 2.2.2. Postup skúšky a návrh skupiny 17 Pokus 1 17 Pokus 2 18 Pokus 3 19 2.2.3. Výber oblastí mozgu 19 2.2.4. [S35] -GTPyS autorádiografia 21 2.2.5. Štúdia väzby [H3] -DAMGO 22 2.2.6. Hodnotenie a štatistika 23 2.3. Výsledky [S35] -GTPyS autorádiografická štúdia 25 Pokus 1 25 Pokus 2 31 Pokus 3 35 2.4. Diskusná [S 35] -GTPγS autorádiografická štúdia 37 3.1. Úvod do koncepcie nízkych dávok naloxónu 42 3.2. Materiál a metódy Koncept nízkych dávok naloxónu 46 3.2.1 Zvieratá a chov zvierat 46 3.2.2 Morfínové pelety 46 3.2.3. Pokusy na otvorenom teréne 47 Podávanie akútnych nízkych dávok naloxónu 47 Senzibilizácia 48 3.2.4. Experimenty v Skinnerových boxoch 49 diskriminácia na lieky 49 Odstúpenie od opiátov v Skinnerových boxoch 50 3.2.5. Pokus v pozorovacích boxoch 51 3.2.6. Hodnotenie a štatistika 52 3.3. Výsledky koncepcie nízkych dávok naloxónu 54 Morfínové pelety 54 Pokusy na otvorenom poli 55 Pokusy v Skinnerových boxoch 58 Pokusy v pozorovacích boxoch 61 3.4. Diskusia o koncepcii nízkych dávok naloxónu 63

4.1. Vyvolanie podmieneného výberu 68 4.2. Materiál a metódy podmieneného stiahnutia 74 4.2.1 Zvieratá a chov zvierat 74 4.2.2. Živočíšny model podmieneného stiahnutia 75 4.2.3. Experiment na otvorenom poli 77 4.2.4. Skúška na hyperalgéziu (varná platňa) 77 4.2.5. Meranie stresových hormónov 77 4.2.6. Porovnanie zvieracieho modelu so stresovou paradigmou 78 4.2.7. hybridizácia in situ 79 4.2.8. Intervencia memantínom 82 4.2.9. Hodnotenie a štatistika 82 4.3. Výsledky podmieneného vysadenia 83 Časť 1: Zvierací model na meranie podmienených abstinenčných symptómov 83 Časť 2: hybridizácia in situ 96 Časť 3: Farmakologický zásah s použitím memantínu 99 4.4. Diskusia o podmienenom vysadení 106 Časť 1: Zvierací model na meranie podmienených abstinenčných príznakov 106 Časť 2: Hybridizácia in situ 109 Časť 3: Farmakologická intervencia s použitím memantínu 111 5. Záver 113 6. Bibliografia 116 Poďakovanie 131 Životopis 132

O aktivite G proteínov spojených s μ-opioidným receptorom pri abstinencii stále nie sú žiadne poznatky, takže otázka, do akej miery je nadmerná neuronálna aktivita pri abstinencii ovplyvnená G proteínmi a ich funkčnosťou, nebola objasnená. Cieľom tejto štúdie je preto preskúmať aktivitu G-proteínov spojených s opioidným receptorom pri odoberaní, berúc do úvahy rôzne parametre. Metódou vyšetrovania je metóda Sim a kol. (1995) ďalej vyvinuli autorádiografiu [S35] -GTPyS, ktorá umožňuje uskutočňovať toto meranie aktivity na prevažne intaktnom úseku mozgu a súčasne určiť presnú anatomickú lokalizáciu tejto aktivity. To tiež umožňuje uskutočniť ďalšie metódy molekulárneho biologického vyšetrenia na rovnakom mozgu (napr. Štúdiu väzby ligandu), aby sa zistili akékoľvek rozdiely v interakcii väzby receptora/aktivácie G proteínu. 16

10 10 +5 +5 0 0 -5 -5 -10 -15 -10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0 -5 +15 +10 +5 0 -5 Nucleus accumbens Interaural 10,60 mm Bregma 1,60 mm 10 10 +5 +5 0 0 -5 -5 -10 -15-10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0-5 +15 +10 +5 0-5 LV Centrálne jadro amygdaly II Interaural 6,70 mm Bregma -2,30 mm 10 10 +5 +5 0 0-5 -5-10 -15-10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0-5 +15 +10 +5 0-5 Locus coeruleus Nucleus parabrachialis Interaural -0,80 mm Bregma -9,80 mm Obr. 4: Ilustrácia a poloha skúmaných oblastí mozgu. Zastúpenie upravené podľa autorov Paxinos a Watson (1998) 20

2.2.6. Vyhodnotenie a štatistika Vyhodnotenie autorádiografie [S35] -GTPyS a štatistika: Vyvinuté filmy sa digitalizovali pomocou videokamery (Sony XC-77) a vyhodnotili pomocou počítača (Optimas, BioScan). Stupeň začiernenia jednotlivých oblastí mozgu sa zaznamenal pomocou denzitometrie a rádioaktivita [S35] sa stanovila porovnaním aplikovaného [C14] štandardu (NEN) a vypočítaného konverzného faktora. Výsledok bol vyjadrený v nci/g. Prepočítavací faktor bol vypočítaný odlúpnutím inkubovaných rezov zo sklíčok, stanovením hmotnosti a rádioaktivity v kvapalnej scintilačnej fotometrii. Prepočítavací faktor bol vypočítaný z úrovní šedej a použitého [C14] štandardu na základe výsledkov kvapalinovej scintilačnej spektrofotometrie. Získané údaje boli vyjadrené ako priemer skupiny ± štandardná chyba (SEM). Štatistické výpočty sa uskutočňovali pomocou dvojfaktorovej analýzy odchýlok (ANOVA, faktor A: základné meranie stimulácie oproti stimulácii DAMGO, faktor B: skupiny). Ako následný post hoc test sa použil Newman-Keulsov test. Ak je pravdepodobnosť chyby p