Model in vitro na meranie imunitných reakcií na maláriu v kontexte koinfekcie HIV

Úvod

Spoločná infekcia, infekcia viacerými súčasnými infekciami, je v prirodzenom prostredí normou. Spoločná infekcia môže mať zásadný vplyv na patológiu ochorenia a klinické zvládanie akejkoľvek infekcie. V súvislosti so súčasnou infekciou môže byť negatívne ovplyvnená vakcína a účinnosť liekov, ako aj diagnostické testy (prehľad v 1). Napriek svojmu významu väčšina výskumu patogénov zvažuje iba jednotlivé infekcie.

Malária a HIV-1 (HIV) sú celosvetovo hlavnými príčinami chorobnosti a úmrtnosti. Oblasti malárie a endemicity HIV majú spoločné veľké geografické prekrytie, čo ohrozuje milióny ľudí závažnejším klinickým ochorením 2-10. Tieto dve choroby interagujú negatívne. U jedincov infikovaných vírusom HIV sa počas infekcie maláriou pozoruje vyššia vírusová záťaž HIV a prechodný pokles počtu CD4 + T buniek, zatiaľ čo zaťaženie parazitmi malárie a riziko klinickej a závažnej malárie sa vyskytujú u súčasne infikovaných jedincov 2,3,5,7, 8,10 vyššie. Mechanizmy, pomocou ktorých HIV zvyšuje závažnosť malárie, nie sú úplne pochopené a vyžadujú si ďalšie vyšetrovanie.

Tu popisujeme metódu, pomocou ktorej je možné in vitro študovať maláriu a koinfekciu HIV. Táto metóda umožňuje predovšetkým štúdium imunitných odpovedí špecifických pre maláriu v súvislosti s infekciou HIV. Náš protokol popisuje všestranný kokultúrny systém čerstvo izolovaných mononukleárnych buniek periférnej krvi (PBMC) od chronicky HIV infikovaných darcov a P. falciparum parazitujúcich erytrocytov (PfRBC) kultivovaných in vitro. Účinky antiretrovírusovej liečby HIV na tieto odpovede možno študovať aj pomocou prospektívne zaznamenaných PBMC od darcov HIV (+) pred a po liečbe.

Použil tento systém na štúdium vplyvu infekcie HIV na vrodené imunitné reakcie špecifické pre maláriu 11,12 a bol schopný určiť, že malárie špecifické reakcie IFNy a TNF sú narušené v NK bunkách, NKT bunkách, γδ T bunky od darcov HIV (+) pred a po HIV antiretrovírusovej liečbe. Okrem toho sme boli schopní pomocou tohto systému určiť, že funkcie monocytov sú tiež narušené u darcov HIV (+), ale zotavujú sa po antiretrovírusovej liečbe HIV.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Tento protokol vyžaduje nábor darcov séra a RBC, ktoré sa majú použiť na kultiváciu parazitov, a HIV (+) a neinfikovaných darcov na izoláciu PBMC. Inštitucionálne kontrolné výbory musia schváliť všetky štúdie a všetci darcovia musia pred odberom krvi poskytnúť informovaný súhlas.

UPOZORNENIE: Práca so vzorkami ľudskej krvi a parazitmi ľudskej malárie vyžaduje preventívne opatrenia. Vždy noste laboratórny plášť, rukavice a pracujte v skrinke na biologickú bezpečnosť úrovne 2. V prípade náhodného perkutánneho vystavenia ľudskej malárii uveďte profilovú liečbu pre zdravie a bezpečnosť. Mali by ste tiež vykonať ďalšie bezpečnostné kontroly týkajúce sa práce s krvou HIV (+). Noste inferenčný laboratórny plášť. Dvojitá rukavica (vrchná rukavica by mala byť latexová). Vykonajte všetku manipuláciu v skrini na biologickú bezpečnosť úrovne 2. Nepoužívajte sklo ani ostré predmety. Nepoužívajte čerpadlo na prúd vody. Vložte všetky kontaminované časti roztoku viroxu alebo bielidla najmenej na 1 hodinu pred likvidáciou. 1 hodinu po aplikácii umyte všetky povrchy prostriedkami virox a UV. Upozorňujeme, že každá inštitúcia bude mať svoje vlastné špecifické nariadenia o biologickej bezpečnosti, ktoré je potrebné dodržiavať. Nahláste akékoľvek náhodné vystavenie zdravia a bezpečnosti krvi infikovanej HIV na vyhodnotenie a zváženie možnej profylaxie po expozícii.

POZNÁMKA: Prítomné sú rôzne kmene parazitov malárie P. falciparum. Pre tieto experimenty sa použil ITG, ale používajú sa rôzne kmene. Vynikajúci návod na zmrazenie a rozmrazenie parazitov Plasmodium falciparum je k dispozícii na webovej stránke MR4 13.

1. Vytvorte RPMI-A pre kultúru malárie

  1. Vyrobte RPMI-0 zmiešaním 950 ml ddH20, 1 balenia prášku RPMI-1640, 6 g HEPES, 2 g hydrogenuhličitanu sodného a 1,35 mg hypoxantínu.
  2. Rozmrazte tepelne inaktivované ľudské sérum od dvoch rôznych darcov. Najlepšie sú darcovia AB, ale každého možno použiť, keď sa parazity pestujú v červených krvinkách typu O (RBC). Zametanie rúrok na premiešanie. Ak sérum obsahuje častice alebo je husté, odstreďte pri 2 000 otáčkach za minútu a potom vyberte tekutú časť pomocou 0,45 um filtračnej jednotky.
  3. Pomocou 0,2 µ m filtračná jednotka filter 180 ml RPMI-0, 20 ml ľudského séra (10 ml od každého darcu) a 0,5 ml 10 mg/ml gentamycínu.
    Poznámka: Ľudské sérum môže upchať filtre, takže je potrebných viac ako jedna filtračná jednotka.
  4. Fľašu s médiom označte pomocou RPMI-A, dátumu a zdroja séra. Chladnite, kým to nie je potrebné. Po ochladení sa môže RPMI-A zakaliť. Je to normálne, ale zvyšujúca sa oblačnosť je známkou kontaminácie.
    Poznámka: Rast parazitov v rôznych sérach darcov sa bude líšiť. Pred použitím je dobré otestovať všetky dávky ľudského séra na dobrý rast parazitov.

2. Príprava ľudských červených krviniek na kultiváciu parazitov

Poznámka: Darcovia krvi by mali byť typu O.

  1. Odoberte 7-10 ml krvi do skúmaviek s kyselinou citrát-dextrózou (ACD). Na štítok napíšte ID darcu a dátum odberu.
  2. Uchovávajte krv pri teplote 4 ° C, pokiaľ to nie je potrebné. Na krvavého parazita použite kultúry do 1 mesiaca.
  3. Horná časť skúmavky sa utrie 70% etanolom. Opatrne odstráňte zátku a zlikvidujte ju. Preneste krv do 15 ml skúmavky. Točte 3 minúty pri 1 000 x g. Odstráňte plazmu odsatím.
  4. Vystavenie RBC rovnakému objemu teplého RPMI-0. Točte 5 minút pri 1 000 x g. Tuková pokožka sa odstráni odsatím, resuspenduje sa v 5 ml RPMI-0 a premytie sa opakuje ešte dvakrát.
  5. Odstráňte supernatant a pridajte toľko RPMI-A, aby sa vytvorila zmes, ktorá je 50% RBC objemovo.
  6. Uchovávajte pri 4 ° C, pokiaľ to nie je potrebné.

3. Udržiavanie parazitických kultúr

4. Synchronizácia parazitov

POZNÁMKA: Deň pred experimentom synchronizujte parazitickú kultúru ošetrením alanínom. Túto liečbu prežijú iba paraziti v kruhovom štádiu a neinfikované RBC. Alanínová synchronizácia vám na druhý deň poskytne čistú trofozoitovú kultúru, ktorú je možné použiť pri kokultivačných experimentoch. Určite začnite s kultúrou parazitov, ktorá obsahuje väčšinu parazitov v kruhovom štádiu.

  1. Pripravte alanín zmiešaním 8,01 g alanínu (300 mM) a 0,365 g Tris (10 mM) v 300 ml ddH20. Upravte pH na 7,4. Filtrovať sterilizovaným spôsobom s použitím 0,2 µ m filtračná jednotka.
  2. Predhrejte roztok alanínu na 37 ° C.
  3. Odstreďte parazitickú kultúru (5 min x 1 000 x g) a odstráňte médium.
  4. Peleta v 19 objemoch roztoku alanínu (1 ml naplneného RBC do 19 ml roztoku alanínu). Inkubácia po dobu 15 minút pri teplote miestnosti.
  5. Točte 5 min x 1 000 x g. Supernatant je odsatý. Raz umyte v RPMI-0. Supernatant sa odsaje a resuspenduje v RPMI-A a nastaví sa hematokrit

3%. Rovnaké ako banka a vráťte na 37 ° C
Poznámka: Pre kokultivačné experimenty sa vyžaduje minimálne 5% parazitémia trofozoitov, pričom za optimálnu sa považuje 10% parazitémia.

5. Príprava parazita a RBC na experimenty spoločnej kultúry

  1. Pri kokultivačných experimentoch použite pomer 3 PfRBC na PBMC na vyvolanie zápalovej reakcie. Na výpočet celkového PfRBC sa kvantifikuje parazitémia odobratím riedkeho krvného náteru, ako je opísané v bode 3.5, a hematokrit spočítaním počtu RBC na ml kultúry parazitov pomocou počítacej komory.
    Počet PfRBC =% parazitémie x celkový počet červených krviniek/ml x ml kultúry. Napríklad: 10 ml kultúry pri 10 x 106 RBC/ml a 10% parazitémii sa rovná 0,1 x 106/ml x 10 ml = 10 x 106 PfRBC.
  2. Kultúra parazita sa otáča 5 minút pri 1000 xg (RT). Aspirujte médium a resuspendujte pri 6 x 106 PfRBC na ml v RPMI-S + (500 ml RPMI-1640, doplneného L-glutamínom a HEPES, 10% teplom doplneného inaktivovaného FBS, 1,5 ml gentamicínu, 5 ml 100 mM pyruvátu sodného, 5 ml 10 mM MEM neesenciálnych aminokyselín, 5 ml 5 mM β-merkaptoetanolu).
  3. Kontrolná krv (neinfikované RBC od rovnakého darcu použitého na uchovanie kultúry parazitov), ​​vypočítaná hematokrit a resuspendovaná v RPMI-S + v rovnakom počte RBC na ml na kultúre parazitov.

6. Izolácia ľudských mononukleárnych buniek periférnej krvi (PBMC)

7. Kultúra súbežnej infekcie malária/HIV

8. Zistenie imunitnej odpovede na maláriu

POZNÁMKA: Vykonajte kokultúrne experimenty 4 dni. Počas tejto doby nie je potrebná žiadna zmena média. Optimálne načasovanie bude závisieť od typu požadovanej bunky a od položenej otázky. Inkubácia 12 až 48 hodín je optimálna pre odpovede monocytov na PfRBC, zatiaľ čo odpovede lymfocytov sa najlepšie pozorovali po 72 až 96 hodinách. Časy bude treba optimalizovať na základe experimentálnej otázky. Kratšie obdobia (2 - 4 h) sa môžu použiť, ak je zaujímavá interakcia medzi intaktnými PfRBC a PBMC.

  1. Doštička sa točí pri 300 x g počas 3 minút na bunkách peliet. Z každej jamky sa zhromaždí 700 μl supernatantu kultúry.
  2. Supernatant bol odstreďovaný pri 1 000 xg po dobu 5 minút, aby sa zabránilo cudzorodým telesám.
  3. Alikvotný podiel sa podľa potreby vyčistil, označil, preniesol a mal teplotu -20 ° C až do analýzy vylučovaných faktorov, ktorá má byť LeistRMED.
  4. Analyzujte odpovede cytokínov/chemokínov pomocou ELISA alebo zostavením guľôčok (postupujte podľa odporúčaných protokolov výrobcu).
  5. Odoberte bunky zostávajúce na platni v stabilizačnom roztoku RNA a použite ich na expresiu mRNA pomocou kvantitatívnej PCR 14-16 v reálnom čase.

9. Intracelulárna prietoková cytometria pre bunkovo ​​špecifické cytokínové odpovede pomocou P. PBMC RBC infikovaných kokultivovaným falciparom

Poznámka: Ako bolo uvedené vyššie, dĺžka kokultúry bude závisieť od požadovaného bunkového typu. V prípade záujmu o monocytové reakcie je potrebná kratšia inkubačná doba PfRBC. Časy dlhšie pre vrodené reakcie lymfocytov (yo T bunky, NK bunky, NKT bunky) a ešte viac pre CD4 a CD8 T bunky. Vyžaduje sa optimalizácia.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Grafy zobrazujú hladiny IFN & ggr; Produkcia NKT buniek (Obrázok 2) s bránami CD56 + CD3 + yδ- na zachovanie populácie buniek NKT (údaje nie sú uvedené). Bunky sa kultivovali 72 hodín pred farbením. Po zafarbení bolo na prietokovom cytometri zaznamenaných 100 000 buniek CD3 +, aby sa získala dostatočne veľká populácia buniek NK, NKT a yδ (požadované bunky). V každom grafe je zobrazených minimálne 5 600 NKT buniek. Produkcia TNF sa získa rovnakým spôsobom (údaje nie sú uvedené). Grafy jasne ukazujú, že IFN & ggr; Produkcia je nižšia v bunkách HIV (+) jedincov oproti HIV (-) jedincom vystaveným PfRBC.

Analýza prietokovou cytometriou je veľmi subjektívna. Preto je dôležité mať pre každý experiment všetky príslušné kontroly (pozri Obrázok 2). Hodnoty pozadia sa vypočítajú pomocou vzoriek FMO, čo umožňuje skutočnú reprezentáciu zafarbenia cytokínmi. Ako pozitívne kontroly sa použijú bunky stimulované PMA/ionomycínom (údaje nie sú uvedené). PMA a ionomycín sú silné stimulátory produkcie cytokínov T-buniek. Nedostatok produkcie IFN v týchto vzorkách by s najväčšou pravdepodobnosťou predstavoval problém s protokolom farbenia. Môžu za to však aj iné premenné, ako je životaschopnosť buniek alebo neaktívne činidlá.

model
Obrázok 1. Ilustrácia dôkazu gradientu Ficoll po roztočení o pozícii PBMC.

meranie
Obrázok 2. Produkcia IFNy y prírodnými zabíjačskými T bunkami. Vývojové diagramy sa získali bránou na bunkách CD56 + CD3 + yy (minimálne 5600 udalostí). Produkcia IFNy je detekovateľná vo vzorke HIV (-) so stimulovaným P. červené krvinky infikované falciparum. Táto cytokínová odpoveď už nie je evidentná v súvislosti s chronickou infekciou HIV. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Náš protokol bol optimalizovaný na najskutočnejšie štúdium koinfekcie HIV-malária in vitro. Najskôr sú potrebné čerstvé ľudské erytrocyty a sérum pre kultúru parazitov malárie. To je rozhodujúce pre udržanie zdravej populácie parazitov malárie. Parazitové lyzáty nemožno nahradiť živými parazitmi, pretože produkcia cytokínov je pri použití živého P omnoho rýchlejšia a intenzívnejšia. RBC infikované falciparum (PfRBC) 17.18. Okrem toho aktivácia bunkových typov, ako sú napríklad NK bunky, vyžaduje celkové množstvo PfRBC a účinne nespracuje lyzáty parazitov. Môže to byť spôsobené potrebou priameho kontaktu medzi PfRBC a leukocytmi alebo to môže byť spôsobené nestabilnou povahou ligandu odvodeného od parazita, ktorý interaguje s receptormi bunkového povrchu 18. Kultúry PfRBC malárie musia byť pred experimentom tiež dobre synchronizované (protokol 4). Synchronizované PfRBC na zlepšenie reprodukovateľnosti experimentálnych údajov. Aj keď tento protokol deSchreiber používa pre kokultúru PfRBC v trofozoitovom štádiu, je možné ho ľahko upraviť pre štúdium PfRBC v kruhovom štádiu.

Ľudské leukocyty sú umelo infikované HIV a táto metóda bola použitá v štúdiách Malaria-HIV Co-Infection Research 20. To však nemodeluje imunitnú dysreguláciu, ktorá vedie k chronickej infekcii HIV. V tomto kokultivačnom systéme používame PBMC izolované od ľudských účastníkov, ktorí sú chronicky infikovaní HIV-1. Ak je pre účastníkov potrebná štúdia, je dôležité túto populáciu starostlivo vybrať. Kritériá začlenenia a vylúčenia sú kľúčové pre zabezpečenie minimálnej variability a maximálnej reprodukovateľnosti. Naše kritériá boli jasná definícia chronickej infekcie HIV (> 1 rok infikovaná HIV, s poklesom počtu CD4 + T buniek> 50 buniek/mm 3/rok) a vylúčenie kohokoľvek so súčasnou infekciou. To zaisťuje, že získané výsledky možno pripísať účinkom chronickej infekcie HIV, a nie inej infekcii. Okrem toho, keďže nás zaujímala vrodená imunitná odpoveď na vylúčenie malárie, boli sme darcami, ktorí mali predchádzajúcu infekciu maláriou.

Kontroly infikované HIV sa používajú pre každého darcu HIV (+) v každom čase vzorkovania, čo umožňuje normalizáciu údajov. Je potrebné pokúsiť sa porovnávať kontroly s ich príslušnými darcami HIV (+) aspoň pre vek, ale prednostne aj pre pohlavie (aj keď v našej predchádzajúcej štúdii 12 sme nepozorovali významný rozdiel v podskupinách buniek alebo v odpovediach cytokínov medzi ženami a mužmi HIV-neinfikovaní účastníci). Ak je naplánovaný prospektívny odber vzoriek, je prospešné udržiavať rovnakú kontrolu infikovanú HIV pre každý čas odberu. Experimentálne odpovede sa líšia v závislosti od niekoľkých faktorov vrátane zdravia PfRBC, ich stupňa synchronizácie, hladín parazitémie a zrelosti PfRBC a hladín hematokritu. Je potrebné dbať na to, aby toľko z nich bolo medzi pokusmi v harmónii. Normalizácia na kontrolu infikovanú HIV umožňuje určité zohľadnenie týchto premenných.

Mať čerstvé bunky je nanajvýš dôležité, aby sa zabránilo umelým výsledkom. Zmrazenie a rozmrazenie vzoriek môže mať významný vplyv na životaschopnosť buniek 21,22, produkciu cytokínov 23 - 26 a fenotypové markery bunkového povrchu 27.

Ak sú osobitne zaujímavé monocyty, je dôležité, aby sa sklo nepoužilo v protokole. Je potrebné dodržiavať monocyty na skle a mnohých ďalších plastoch 28. Používame polypropylénové plastové pipety, pipety a tuby všade, aby sme minimalizovali adhéziu monocytov a konečné odstránenie z populácií bunkových štúdií.

Popísaný protokol je univerzálny, ktorý je možné použiť na štúdium reakcií v priebehu niekoľkých hodín alebo dní, v závislosti od požadovaných buniek. Pre optimálnu produkciu cytokínov indukovanú PfRBC z vrodených lymfocytov sme merali základnú prietokovú cytometriu po 2 alebo 3 dňoch. Pri pohľade na monocyty sa odporúčajú skoršie časové body (1 alebo 2 dni). Tento systém umožňuje odlíšenie viacerých typov buniek a bunkových odpovedí prietokovou cytometriou, meranie sekrečných reakcií v bunkových supernatantoch a hodnotenie expresných profilov v extrahovanej RNA. Ďalej použitie protilátok na blokovanie alebo neutralizáciu špecifických receptorov; v tomto systéme sa môžu použiť cytokíny na ďalšiu disekciu mechanizmov. Úspešne sme použili blokádu receptora IL-18 na naznačenie receptora IL-18 v reakciách IFN12 indukovaných PfRBC. Tento systém poskytuje realistickú metódu, pomocou ktorej je možné hodnotiť celý rad vrodených imunitných reakcií na maláriu súvisiacich s infekciou HIV.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.