Oddelenie fyziológie výživy - PDF na stiahnutie zadarmo

Predsedníčka nutričnej fyziológie Vplyv izoflavonoidov genisteínu a daidzeínu na proteóm ľudských endotelových buniek in vitro a mononukleárnych krvných buniek in vivo v kontexte ich predpokladanej antiaterogénnej aktivity Dagmar Fuchs Kompletná kópia vedeckého centra Weihenstephan Science for Nutrition, Land Use and Environment pri Technickej univerzite v Mníchove Získanie stupňa doktorandskej dizertačnej práce. Predseda: Univ.-Prof. DR. rer. nat. Michael Schemann Recenzent dizertačnej práce: 1. Univ.-Prof. DR. rer. nat. Hannelore Daniel 2. univ.-prof. DR. rer. nat. Gerald Rimbach, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Dizertačná práca bola predložená na Technickú univerzitu v Mníchove 6. apríla 2006 a prijatá Weihenstephan Science Center for Food, Land Use and Environment 19. júna 2006.

oddelenie

Obsah iii 10.6 Použité primery. 142 10.7 Chemikálie a spotrebný materiál. 143 10,8 Zariadenia. 146 10.9 Pufre a roztoky. 147 10.10 Poďakovanie. 152 10.11 Životopis. 153

1 Úvod 5 Proces regulovaný oxysterolmi a cytokínmi rozhodujúcim spôsobom určuje stabilitu plaku (Lusis AJ, 2000). Obr. 1.2 Schematické znázornenie raných fáz aterogenézy. Endoteliálna vrstva je poškodená: LDL preniká do intimy, kde sa oxidačne mení. Monocyty sa dostanú do steny cievy a absorbujú oxidované častice LDL, takže sa vytvárajú penové bunky (Stipanuk MH, 2000). MM-LDL, mierne oxidovaný LDL; ox-ldl, oxidovaný LDL; M-CSF, faktor stimulujúci kolónie makrofágov; MCP-1, monocytový chemotaktický proteín.

1 Úvod 7 Obr. 1.4 Metabolizmus homocysteínu (upravené podľa Biesalski HK & Grimm P., 2004) Genetický základ hyperhomocysteinémie Hyperhomocysteinémia (HHcy), ktorá je spôsobená chybou genetického enzýmu alebo nedostatočným prísunom jedného alebo viacerých vitamínov podieľajúcich sa na metabolizme homocysteínu. je dôležitým nezávislým rizikovým faktorom pre aterosklerózu (Clarke R a kol., 1991; McCully KS, 1996; Selhub J, 1999; Ueland PM a kol., 2000). HHcy možno rozdeliť do troch rôznych stupňov závažnosti. Mierna forma, ktorá postihuje 5 - 7% populácie, má plazmatické hladiny nad 10 µmol/l Hcy. Plazmatická hladina pacientov so stredne závažnou HHcy je vyššia ako 30 µmol/l a v závažnom variante nad 100 µmol/l (Brattstrom L & Wilcken DEL, 2000). Aj pri miernej HHcy je riziko vzniku aterosklerózy zvýšené (Lawrence de Koning AB a kol., 2003), pričom vzťah k úmrtnosti je najvyšší pri plazmatických hladinách nad 15 µmol/l (Nygard O a kol., 1997). HHcy môže byť spôsobený rôznymi genetickými poruchami, ktoré ovplyvňujú enzýmy cystationín-p-syntáza, metyléntetrahydrofolátreduktáza (MTHFR) a metionín syntáza (Medina MA & Amores-Sánchez MI, 2000). Dôležitosť týchto enzýmových defektov je vysvetlená v nasledujúcich častiach. Najbežnejšou príčinou závažnej HHcy alebo homocystinúrie je autozomálne recesívny, homozygotný nedostatok cystationín-p-syntázy. Bolo opísaných viac ako 60 rôznych mutácií génu s výmenou

1 Úvod 13 Fosfoglyceridy sa znižujú. Estery cholesterolu tvorené LCAT sa usadzujú vo vnútri HDL. Cholesterol pochádzajúci z membrán extrahepatálneho tkaniva sa tak môže viazať na povrch HDL, čo vedie k tvorbe frakcie HDL 3. LCAT katalyzované reakcie a absorpcia látok (fosfolipidy, apolipoproteíny C a E), ktoré sa uvoľňovali počas štiepenia VLDL, vedú k HDL 2 a HDL 1, ktoré sa nakoniec štiepia v pečeni (pozri obr. (Löffler G & Petrides PE, 2003). Obr. 1.5 Postprandiálny metabolizmus lipidov. Postprandiálny metabolizmus lipidov je rozdelený na exogénny, endogénny a reverzný lipidový prenos. (CETP, proteín prenosu esteru cholesterolu) (Deetjen et al., 2004).

1 Úvod 18 Agonisty BAX a BCL-X sú založené na uvoľňovaní pro-apoptotických faktorov, najmä cytochrómu C, z mitochondrií. Väzbou na faktor 1 spojený s apoptózou a kaspázu 9 vytvára cytochróm C takzvaný apoptozóm, ktorý aktivuje kaspázu-3 a tým uvádza apoptózu do pohybu. Koncentrácia antiapoptotických členov rodiny Bcl-2, ktorá inhibuje uvoľňovanie cytochrómu C z mitochondrií, je znížená ox-ldl (Metzler B a kol., 2000; Napoli C a kol., 2000). Ďalej ox-ldl zvyšuje expresiu cytokínov, ako sú IL-1, TNF a PDGF, ktoré naopak aktivujú SAPK/JNK (Metzler B a kol., 2000). Prostredníctvom procesu, do ktorého sú zapojené lyzozómy a lyzozomálne proteázy, môže ox-ldl tiež spôsobiť apoptózu relatívne nezávisle od kaspáz (Salvayre R et al. 2002).

4 Výsledky 38 Obr. 4.2 Reprezentatívna 2D PAGE proteínov z HUVEC, ktoré sa kultivovali s 5 ug/ml ox-ldl v neprítomnosti a v prítomnosti 2,5 um alebo 25 um genisteínu. Čísla spotov sú rovnaké ako v tabuľke 10.2. Vyšetrenia týkajúce sa účinku zmesi izoflavonoidov genisteínu a daidzeínu, ako aj extraktu S40cl na proteóm HUVEC nebolo možné vykonať, pretože bolo potrebné uchovať v kultúre veľmi veľké množstvo HUVEC, aby sa získalo dostatočné množstvo proteínu na analýzu proteómu, čo z technických a finančných dôvodov sa nedali realizovať.