Separačné proteíny pre hmotnostnú spektroskopiu - LABO ONLINE

Oddeľte proteíny pre hmotnostnú spektroskopiu

Jednoduchý odhad sa zmení na viac meraní

Dvojrozmerná kapilárna elektroforéza umožňuje online charakterizáciu proteínov separovaných gélovou elektroforézou pomocou hmotnostnej spektrometrie. Túto metódu popisujú autori vo svojom článku pre LABO.

Gélová elektroforéza na separáciu proteínov podľa ich veľkosti bola predstavená pred 50 rokmi [1] a vyvinula sa v najrozšírenejšiu separačnú technológiu svojho druhu. K analyzovanému proteínu alebo proteínu sa pridá dodecylsulfát sodný (SDS), ktorý tvorí komplex s proteínmi. Výsledný negatívny náboj komplexu SDS-proteín pokrýva vnútorný náboj proteínu a je úmerný veľkosti proteínu. Výsledkom je, že pri podobných pomeroch náboja k hmotnosti sú komplexy teoreticky oddelené iba na základe svojej veľkosti v elektrickom poli separačným gélom, zvyčajne polyakrylamidovým gélom (PAGE). Porovnaním migrácie proteínov, ktoré sa majú analyzovať, s migráciou proteínov so známymi hmotnosťami je možné odhadnúť neznámu hmotnosť pomocou extrapolácie. SDS-PAGE sa používa na stanovenie proteínových hmôt a na separáciu komplexných proteínových zmesí na základe ich veľkosti.

Kvôli relatívne vysokým laboratórnym a časovým nákladom bola táto analytická technika optimalizovaná tak, aby separácia už neprebehla v separačnom lôžku, ale v kapiláre z kremenného skla (CE (SDS)). Táto kapilára má vnútorný priemer väčšinou 50 um a je naplnená separačným gélovým tlmivým roztokom. To sa líši od separačného gélu bežne používaného v SDS-PAGE v tom, že sa používajú vo vode rozpustné lineárne alebo len mierne zosieťované polyméry (namiesto zosieťovaných polymérov), aby bolo možné vymeniť separačný gélový pufer v kapiláre [2]. Môže sa tak automatizovať separácia v kapiláre a zvyšuje sa reprodukovateľnosť. Ďalšou podstatnou výhodou separácie v kapiláre je online detekcia pomocou UV absorpcie alebo fluorescencie. To umožňuje kvantitatívne stanovenia a časovo náročná fixácia a farbenie separovaných proteínov už nie sú potrebné.

Témy v článku

CE (SDS) sa v biofarmaceutickom priemysle široko používa na testovanie a charakterizáciu čistoty a degradačných produktov terapeutických proteínov, ako sú protilátky. Analýza sa preto zameriava na separáciu a kvantifikáciu vznikajúcich fragmentov. Identifikácia týchto fragmentov je ďalším dôležitým bodom, pretože môžu ovplyvniť účinnosť terapeutického proteínu, a tým aj bezpečnosť pacienta.

Nepresné stanovenie hmotnosti extrapoláciou

Identifikácia sa ukazuje ako obrovská výzva. Pretože účinnosť separácie CE (SDS) často nie je dostatočná, môže to viesť k tomu, že sa niekoľko fragmentov bude skrývať za vrcholom. To sťažuje priraďovanie vrcholov k fragmentom pomocou experimentov s narastaním (pridávanie fragmentov, ktoré už boli identifikované, a pozorovanie nárastu plochy píku). Identifikácia pomocou odhadnutej hmotnosti proteínu pomocou extrapolácie tiež nie je možná. Pretože bez ohľadu na to, či sa separácia proteínov SDS uskutočňuje v kapiláre alebo v polymerizovanom géli, je stanovenie hmotnosti nepresné. Pomer viazaného SDS k proteínu sa navyše môže líšiť v závislosti od sekvencie a štruktúry proteínu, čo znamená, že špecifická hmotnosť sa môže ešte viac líšiť od skutočnej hmotnosti [3 - 4].

Nepresné stanovenie hmotnosti neumožňuje jednoznačnú identifikáciu nečistôt. Stanovením presnej hmotnosti týchto fragmentov pomocou hmotnostnej spektrometrie (MS) je však možná identifikácia. Priama väzba CE (SDS) bohužiaľ nie je možná, pretože vysoko viskózny separačný gélový pufor obsahuje dextrán a neprchavé zložky, ako je boritan - predovšetkým však povrchovo aktívna látka SDS, čo vedie k úplnému potlačeniu proteínu v ionizačnom procese [5]. Zvýšenie škály tejto metódy CE (SDS) pre možný zber frakcií s následnou offline prípravou vzorky z hľadiska kompatibility s MS nie je možné kvôli malým objemom a vysoko viskóznemu separačnému gélovému pufru.

Online hmotnostná spektrometria prostredníctvom dvojrozmernej kapilárnej elektroforézy

Náš prístup k online spojeniu MS je založený na prepnutí druhej separačnej dimenzie vo forme kapilárnej zónovej elektroforézy (CZE) medzi separáciou CE (SDS) a MS (obr. 1a) [6]. Toto umožňuje oddelenie zložiek nekompatibilných s MS od analytu. Na vyriešenie veľmi stabilného SDS-proteínového komplexu potrebného na predchádzajúcu separáciu je potrebné ďalšie spracovanie vzorky. Pre túto dekomplexáciu komplexu SDS-proteín bola preto vyvinutá online stratégia v druhej dimenzii separácie. Spočíva v spoločnom vstrekovaní organického rozpúšťadla (tu metanolu) a katiónového povrchovo aktívneho činidla (tu cetylltrimetylamóniumbromidu (CTAB)), ktoré je umiestnené pred alebo za komplexom proteínov SDS v kapiláre druhej deliacej dimenzie.

proteíny

Prepojenie generickej CE (SDS) separácie v prvej separačnej dimenzii s CZE v druhej separačnej dimenzii sa uskutočňuje pomocou nanoliterového ventilu so štyrmi pripojeniami (VICI). Týmto ventilom je možné privádzať vysoké napätie (asi do 15 kV), ktoré je potrebné na oddelenie. Interná vzorkovacia slučka v rozsahu nanoliterov (4, 10 alebo 20 nl) umožňuje prenos týchto veľmi malých objemov z jednej dimenzie do druhej.

Meranie fragmentov intaktnej, tepelne namáhanej protilátky pomocou dvojrozmerného kapilárneho elektroforetického systému je znázornené na obrázku 2. Bolo možné generovať hmotnostné spektrum oboch píkov v dimenzii CE (SDS). Ukázalo sa, že pod každým píkom CE (SDS) nie je ukrytý iba jeden, ale niekoľko fragmentov. Pre pík 1 (obr. 2, modrý) možno fragment 1C (23439,4 ± 1,5 Da) priradiť k ľahkému reťazcu protilátky. Fragment 1B s hmotnostným rozdielom 103,7 Da k ľahkému reťazcu 1C mohol byť spôsobený C-koncovým štiepením cysteínu a 1A ďalšou elimináciou vody. Pre druhý vrchol CE (SDS) (obr. 2, zelený) boli tiež tri fragmenty protilátky. Hmotnosť píku 2C 47638,2 ± 0,7 Da sa identifikovala ako fragment Fab. Eliminácia posledných dvoch (T-H, ∆M = 238,2 Da) alebo troch aminokyselín (K-T-H, ∆M = 366,2 Da) elimináciou vody z tohto fragmentu Fab vedie k hmotnostným vrcholom 2B a 2A.

Záver a výhľad

S tu prezentovanou metódou dvojrozmernej kapilárnej elektroforézy je možné získať online hmotnostné spektrum predtým separovaných proteínov CE (SDS) bez ďalšej prípravy vzorky. S presnými rozmermi je možné identifikovať znečisťujúce látky v biofarmaceutických výrobkoch a podporiť optimalizáciu procesu výroby zodpovedajúcich liekov.

Literatúra:
[1] Laemmli Nature 1970, 227, 680-685.
[2] Zhu a kol. Anal Chim Acta. 2012, 709, 21-31.
[3] Guan a kol. Sci Rep 2015, 5, 13370.
[4] Rath a kol. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106 (6), 1760-1765.
[5] Rundlett a kol. Anal Chem 1996, 68 (19), 3493-3497.
[6] Römer a kol. Anal Bioanal Chem 2019, 411 (27), 7197-7206.

AUTORI

Jennifer Romer 1
Cristina Montealegre 1
Bernd Moritz 2
Steffen Kiessig 2
Christian Neusüß 1
1 Aalen University, katedra chémie
2 F. Hoffmann-La-Roche Ltd, Bazilej, Švajčiarsko