Vplyv prenatálneho stresu na myelinizáciu a tvorbu neurónovej siete
1 Vplyv prenatálneho stresu na myelinizáciu a tvorbu neurónovej siete v mozgu ovčieho plodu Dizertačnú prácu na získanie akademického titulu doctor medicinae (Dr. med) predložila Rade lekárskej fakulty Univerzity Friedricha Schillera v Jene Julia Quendt narodená 5. mája. Septembra 1987 v Gothe
2 recenzenti: 1. Prof. Dr. med. Matthias Schwab/Jena 2. Prof. Dr. med. Richard Berger/Neuwied 3. PD Dr. med. Deň verejnej obrany Bernd Romeike/Jena:
3 Obsah Obsah I ZOZNAM SKRATIEK I 1 ZHRNUTIE 1 2 ÚVOD Klinický význam prenatálneho stresu pre vývoj plodu Mozog plodu Embryonálny vývoj mozgu Proliferácia a migrácia buniek Neurónová a gliová diferenciácia Neuronálna a gliová diferenciácia Štruktúra mozgovej myelinizácie a biochemické zloženie funkcie myelínového obalu a význam myelínu Myelinácia Účinky prenatálneho stresu na vývoj mozgu plodu Cerebrálne účinky stresu matky Cerebrálne účinky prenatálnej liečby glukokortikoidmi Regulácia stresovej osi Účinky stresu matky a prenatálnej liečby glukokortikoidmi na vývoj stresovej osi Mechanizmy účinkov prenatálneho stresu Prenos stresu matky na plod glukokortikoidov Prenatálny stres a rastové hormóny Cieľ práce 22
4 Obsah 3 MATERIÁL A METÓDY Experimentálne Experimentálny protokol Extrakcia mozgov plodu a príprava vzoriek Histochemické a imunohistochemické farbenie Prehľad farbenia hematoxylín-eozínom Strieborná impregnácia podľa Bielschowského Imunohistochemická detekcia MBP Svetelné mikroskopické a PC hodnotenie telesnej hmotnostiUL Výsledky štatistického vyhodnotenia 39 4 prenatálny stres mozgové účinky prenatálneho stresu tvorba nervových procesov v bielej hmote subkortikálna biela hmota corpus callosum hlboká biela hmota corona radiata capsula interna myelinácia nervových procesov v bielej hmote subkortikálna biela hmota corpus callosum hlboká biela hmota - corona radiata capsula interna tvorba nervových štruktúr v Hipokampus (oblasť CA3) 64
5 Obsah 5 DISKUSIA Diskusia k metódam zvierací model Stresový model Histológia Kvantitatívna analýza obrazu Diskusia k výsledkom Prenatálny stres a rast plodu Účinky po prenatálnom strese na hipokampus Cerebrálne účinky po prenatálnom strese na neurónovú sieť Cerebrálne účinky po prenatálnom strese na myelináciu 82 6 ZÁVERY 84 7 DOSAHY 86 8 PRÍLOHA Poďakovanie Čestné vyhlásenie 103
6 Zoznam skratiek Zoznam skratiek ABC ACTH ADHD AK AP AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) CRH GR GT HE HHN osa 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidín-Biotín-Komplex Adrenokortikotropný hormón Porucha pozornosti/porucha hyperaktivity Pracovný tlmivý roztok Pracovný tlmivý roztok + Triton-X-100 pracovný tlmivý roztok + Triton + sérum Aqua destillata (destilovaná voda) arginín-vazopresín betametazón 2-3-cyklický nukleotid 3-fosfohydroláza (placenta) hormón uvoľňujúci kortikotropín glukokortikoidový receptor gestačný deň (dni) hematoxylín-eozín hypotalamus-hypofýza os Hydroxysteroid dehydrogenáza typu 2 Inzulín podobný rastový faktor S myelínom asociovaný glykoproteín Myelínový bázický proteín Myelín/oligodendrocytový glykoproteín Mineralokortikoidový receptor Priemerná hodnota Oligodendrocytový myelínový proteín Fosfátový tlmivý roztok Proteolipidový proteín Rýchly pohyb očí Štandardná chyba strednej hodnoty
18 2 Indukcia perventrikulárnej leukomalácie (poškodenie bielej hmoty počas predčasného pôrodu) okolo 0,65 gestačného obdobia (zodpovedá týždňu tehotenstva u ľudského plodu), vysoký stupeň porovnateľnosti vývoja mozgu medzi ovcami plodu a ľuďmi. Podporila to skutočnosť, že v tomto časovom okne začína dozrievanie oligodendrocytov vo fetálnom mozgu oviec a súčasne je možné pozorovať vysoké riziko poškodenia nezrelej periventrikulárnej bielej hmoty u predčasne narodených detí (Back et al. 2006, 2001). . V čase narodenia vykazuje mozog stvorenej osoby o niečo vyšší stupeň zrelosti ako ľudský (McIntosh et al. 1979, Astrom 1967). To by mohlo naznačovať, že tvorivá myseľ v poslednom trimestri dozrieva rýchlejšie. 12
23 2 Úvod koordinovaná fyziologická odpoveď na rôzne koncentrácie kortizolu (kapitola 2.4.2). Obr.2.3: Os hypotalamus-hypofýza-nadobličky a cesty negatívnej spätnej väzby. Hormón uvoľňujúci kortikotropín (CRH), arginín vazopresín (AVP), proopiomelanokortín (POMC), adrenokortikotropný hormón (ACTH), paraventrikulárne jadro (NPV). Upravené z Metthews
30 2 Úvod ukazuje podobný časový vývoj mozgu ako človek, aj keď zreje o niečo rýchlejšie. Celkovo bol hodnotený mozog 45 pracovníkov, ktorí boli chronicky stresovaní v rozmedzí od 0,20 do 0,66 gravidity (GT) 180-minútovou izoláciou dva dni v týždni. Pretože ovce sú stádové zvieratá, izolácia je pre tento druh hlavným stresujúcim faktorom. Aby sa preukázali možné trvalé účinky, mozgy sa hodnotili v čase 0,73 (110. GT, doba gravidity 150 dní) a 0,86 gestácie (130. GT). Výsledky majú pomôcť objasniť účinky prenatálneho stresu na funkciu mozgu v neskoršom veku. 24
32 3 Materiály a metódy Izolované na dosku iných zvierat, takže na konci protokolu bolo každé zviera 20-krát vystavené individuálnej izolácii. Pretože ovce sú stádové zvieratá, sú na tento stresor obzvlášť citlivé. Meranie hladiny kortizolu pred a počas izolácie dokázalo tento účinok potvrdiť (Rakers et al. 2012). Stresová skupina Kontrolná skupina Synchronizácia cyklu rodu a plánované párenie V POROVNANÍ Vhodný chov vo voľnom výbehu u pastiera Preprava gravidných zvierat do testovacieho laboratória Stres izoláciou 2-krát týždenne po dobu 3 hodín Chronické prístrojové vybavenie Získanie plodových mozgov - skupina 1 Získanie plodových mozgov - skupina 2 Prirodzený termín pôrodu Obr. .3.1: Experimentálny protokol Medzi 100. a 110. GT boli plody inštrumentované pomocou katétrov, ktoré sa používali na kontrolu vnútromaternicových stresových reakcií (uvoľňovanie ACTH a kortizolu). Ich hodnotenie nie je predmetom tejto práce (pozri Rakers 2012). Po ukončení experimentov a operatívnom vývoji plodov sa stanovila ich telesná a mozgová hmotnosť. Tieto merania sa uskutočnili 26. dňa
36 3 Materiál a metódy vzostupného alkoholového radu dehydratovaného a uzavretého montážnym médiom Neo-Mount (MERCK GmbH, Darmstadt, Nemecko). Podrobný protokol zafarbenia je uvedený v tabuľke 3.2. Stredné odparafínovanie: 2x Neoclear 2x izopropanol 100% 1x izopropanol 80% 1x izopropanol 50% destilovaná voda. Impregnácia striebrom: AgNO 3 20% 2x aqua dest. Roztok amoniakálneho dusičnanu strieborného destilovaná voda + nh 3 (4: 1) tiosíran sodný 5% voda z vodovodu destilovaná voda. Dehydratácia: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x Inklúzia nejadrového balzamu s celkovým časom [min]/teplotou [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90///RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Tabuľka 3.2: Protokol pre impregnáciu striebrom podľa Bielschowského. Teplota miestnosti. Roztoky sa pripravia nasledujúcim spôsobom: 20% roztok dusičnanu strieborného (AgNO3): 100 ml destilovanej vody g dusičnan strieborný 5% tiosíranu sodného (Na2S203): 100 ml destilovanej vody. + 5 g tiosíranu sodného pre roztok vývojky: 25 ml destilovanej vody, mg kyseliny citrónovej (Fluka Chemie, Buchs, Nemecko) + 5 ml 36% formalínu (Carl ROTH GmbH, Karlsruhe, Nemecko) + 8 ul koncentrovanej kyseliny dusičnej HNO 3 (Fluka Chemie, Buchs, Nemecko). 30
40 3 Materiál a metódy 2xAP + T ABC komplex: AP + T + roztok A + roztok B AP + T 2x PBS destilovaná voda. 3'3-diaminobenzidín (DAB) 2x aqua dest. Dehydratácia: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x Neoclear 100% balzam zahrnutý s Entellanom 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 20 ul každého z roztokov A a B v 1 ml AP + T1Set (H2O2 + DAB) pre 5 ml destilovanej vody, prefiltrujte filtrom Millipore. Tabuľka 3.3: Protokol pre imunohistiochemickú detekciu MBP. Roztoky sa pripravia nasledujúcim spôsobom: Citrátový pufor: 1 liter destilovanej vody. + 2,94 g citrátu sodného (Fluka Chemie, Buchs, Nemecko), pH 6,0. PBS: 1 liter destilovanej vody. + 1 g pracovného tlmivého roztoku D-PBS: 500 ml PBS + 2,5 g hovädzieho sérového albumínu (albumín z hovädzieho séra, minimálne 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Nemecko) ul TWEEN 20 (polyoxyetylénsorbitanmonolaurát) (Sigma-Aldrich Chemie) GmbH, Sternheim, Nemecko) ph 7.5. Roztok DAB (substrát Sigma Fast DAB): 2 tablety (peroxid vodíka močoviny a 3,3-diaminobenzidín) v 5 ml destilovanej vody. krúžte, kým sa hotové tablety úplne nerozpustia. 34
42 3 Materiál a metódy Obr.3.3: Farbenie prehľadu H&E upravené podľa The Sheep Brain Atlas, Michigan State Unversity Brain Biodiversity Bank, National Science Foundation Vľavo: Subkortikálna biela hmota vo frontálnej kôre: blízko kôry [1] a vzdialene od kôry [2]; Corpus callosum [3]; Corona radiata [4]; Vnútorná kapsula [5]; SV: bočná komora. Vpravo: oblasť CA3 v hipokampe: ventrálna časť [1], chrbtová časť [2] 36
43 3 Materiál a metódy Po digitálnom uložení boli záznamy vyhodnotené v programe na spracovanie obrazu (Scion Image 1.62 NIH, USA). Najskôr boli farebné obrázky prevedené na čiernobiele obrázky s 256 odtieňmi šedej. Plocha pozitívneho značenia v reprezentatívnom reze bola stanovená pomocou obrazovej analýzy. Plocha impregnácie imunoštítkom/striebrom odráža imunohistochemickú distribúciu antigénu/hustotu bunkových procesov. V porovnaní s mikroskopickým obrazom bola horná a dolná prahová hodnota nastavená pod vizuálnou kontrolou. Tieto prahové hodnoty tvoria rozsah pre selektívne znázornenie pozitívnej imunoreaktivity MBP alebo strieborných nervových vlákien. (pozri obr. 3.4, červené označenie). Obr.3.4: Analýza obrazu pomocou hodnôt šedej A: Mikroskopický obraz: Neuronálne procesy v subkortikálnej bielej hmote frontálnej kôry vzdialenej od kôry. 37
44 3 Materiál a metódy B: Značenie zafarbených rozšírení buniek na obrázku v odtieňoch šedej V porovnaní s mikroskopickým obrázkom je na obrázku v odtieňoch šedej definovaná šedá oblasť (na obrázku označená červenou farbou), ktorá zodpovedá pozitívnemu signálu impregnácie striebrom. Táto oblasť sa meria programom na analýzu obrazu. 38
61 Plocha MBP-IR [10-3 mm²] 4 výsledky Subkortikálna biela hmota - v blízkosti mozgovej kôry 1,00 0,50 $$$ $$$ (n = 9) (n = 11) Kontrolné napätie (n = 15) (n = 10) 0, gestačný vek [d] Obr. 4.18: Účinky veku a stresu na myelinizáciu neuronálnych procesov v subkortikálnej bielej hmote frontálnej kôry blízko kôry. MW ± SEM. $$$ p 62 4 Výsledky Bunkové telá a nervové procesy v subkortikálnej bielej hmote vzdialenej od kôry sú zreteľne označené ako MBP-pozitívne (obr. 4.19). Obr. 4.19: Mikrofotografie nervových procesov v subkortikálnej bielej hmote frontálnej kôry vzdialenej od kôry. Imunohistochemická detekcia MBP. Telo bunky neuronálneho procesu A: kontrolné zviera v deň gravidity 110 B: stresové zviera v deň gravidity 110 C: kontrolné zviera v deň gravidity 130 D: zviera stresujúce v deň gravidity 130
72 Plocha impregnácie striebrom [10-3 mm²] 4 výsledky 1,50 Oblasť Hippocampus CA 3, ventrálna časť 1,00 $ 0,50 (n = 9) (n = 7) (n = 6) * (n = 8 ) Kontrolný stres 0, gestačný vek [d] Obr.4.29: Účinky veku a stresu na neurálnu sieť v oblasti CA3 hipokampu, ventrálna časť. MW ± SEM; * str. 73 4 Výsledky Obr. 4.30: Mikrofotografie neurónovej štruktúry v oblasti CA3 hipokampu, chrbtová časť. Impregnácia striebrom. Bunka s jadrom Neuronálny proces A: kontrolné zviera v deň gravidity 110 B: stresové zviera v deň gravidity 110 C: kontrolné zviera v deň 130 gravidity D: stresové zviera v deň gestácie 130