Vzťahy medzi zhlukmi oxidačne poškodených nukleotidov a aktívnymi alebo otvorenými nukleozómami

predmetov

abstraktné

Distribúcia oxidačného poškodenia na báze, ako je 8-hydroxyguanín (8-OH-Gua), sa stanovila na úrovni štiepenia nukleotidov pomocou ligáciou sprostredkovanej techniky PCR. Je známe, že podávanie renálneho karcinogénu, nitrilotriacetátu železitého (Fe-NTA), indukuje oxidačný stres a následnú tvorbu 8-OH-Gua v obličkách. Celková genómová DNA sa izolovala z obličky potkana s ošetrením alebo bez Fe-NTA a potom sa štiepila formamidopyrimidínovou DNA glykozylázou (Fpg). Ako cieľ sme sa zamerali na gén enzýmu na opravu DNA pre tymínglykol, Nth 1. Štiepené signály sa našli v exóne 1 a exóne 3, ale nie v exóne 5. Nukleozómy obohatené o poškodené nukleotidy v týchto oblastiach boli vysoko prístupné pre mikrokokokovú nukleázu, najmä v obličkách. S prihliadnutím na funkciu proteínového segmentu kódovaného týmito oblasťami sme diskutovali o molekulárnom mechanizme obmedzenej tvorby poškodených nukleotidov.

úvod

Reaktívne formy kyslíka (ROS) indukujú rôzne typy poškodenia DNA, napríklad jednoreťazcové zlomy, dvojvláknové zlomy, bázické modifikácie vrátane miest s apurínom a apyrimidom a sieťovanie DNA-proteínov (Dizdaroglu, 1991, 1992; Halliwell a Aruoma, 1991)). Predpokladá sa, že pri rakovine a starnutí hrá úlohu oxidačné poškodenie bunkových genómov (Akman a kol., 1991; Basu a kol., 1989; Feig a kol., 1994; Loeb a kol., 1988; Maccabee a kol., 1994; McBride a kol., 1991; Moriya a kol., 1991; Tkeshelashvili a kol., 1991; Weitzman a Gordon, 1990; Wood a kol., 1990). 8-Hydroxyguanín (8-OH-Gua) je hlavná forma oxidačného poškodenia DNA (Kasai a Nishimura, 1993; Umemura a kol., 1990), ktoré hlavne indukuje transkripcie GC → TA v bunkách Escherichia coli a cicavcoch (Cheng a kol. 1992). Odchýlky v množstve 8-OH-Gua v bunkovej DNA je možné merať pomocou HPLC-ECD (Floyd a kol., 1986; Kasai, 1997). Vzťah medzi indukovaným poškodením DNA a mutačnými spektrami však nebol objasnený, pretože vhodná metóda na detekciu poškodených nukleotidov v DNA in vivo ešte nebola stanovená.

Nedávno ligáciou sprostredkovaná PCR (LM-PCR) priniesla prielom v detekcii poškodených nukleotidov na úrovni nukleotidového rozlíšenia (Denissenko et al., 1996). LM-PCR bola pôvodne vyvinutá pre genómové sekvenovanie vrátane detekcie metylačných miest CpG a tiež pre stopu in vivo (Konishi a kol., 1995; Mueller a Wold, 1989, 1991; Nomoto a kol., 1995; Pfeifer a kol., 1989). Odvtedy sa aplikuje na analýzu miest štiepenia nukleázou, napríklad mikrokokokovou nukleázou alebo štiepením DNázou I, na výskum chromatínu (Kato et al., 2000).

Proteínový segment kódovaný exónmi 1 a 2 je jedinečný pre cicavčí Nth 1 a obsahuje jadrové a mitochondorické zameriavacie signály a putatívne interakčné miesta pre ďalšie opravné zložky. Proteínový segment zodpovedný za bifunkčné enzymatické aktivity, aktivitu DNA glykozylázy a aktivitu AP lyázy je kódovaný exónmi 3 až 6. Za účelom stanovenia molekulárneho mechanizmu obmedzenej tvorby poškodených nukleotidov v exónoch 1 až 4 sme analyzovali chromatínovú štruktúru pečene, obličiek a sleziny u kontrolných potkanov. Nukleozómy v exónoch 1 až 4 génu Nthl boli ľahko prístupné pre MNázu, najmä v obličkách. Toto pozorovanie by mohlo poskytnúť indikáciu citlivosti na renálnu karcinogenézu.

Výsledky

Regionálne obmedzená tvorba poškodených nukleotidov v géne Nth 1

poškodených

Distribúcia poškodených nukleotidov v géne Nth 1. ( a ) Distribúcia miest štiepených piperidínom alebo štiepených Fpg na genómovej DNA z obličiek v špecifikovaných časoch po liečbe Fe-NTA alebo kontrolnej obličke bez liečby sa analyzovala pomocou LM-PCR. Genomická DNA z obličiek kontrolných zvierat tiež reagovala s DMS, potom bola štiepená piperidínom a použitá ako guanínový (G) rebrík. Sú zobrazené profily štiepenia neprepisovaného vlákna v exóne 1 génu Nthl. „Txn“ označuje polohu miesta predbežného začatia transkripcie. ( ) Distribúcia miest strávených Fpg na genómovej DNA, ako je opísané vyššie. Sú zobrazené profily štiepenia neprepisovaného vlákna v exóne 3 génu Nth1. ( c ) Je znázornená distribúcia miest štiepených Fpg na neprepisovanom vlákne v exóne 5 génu Nth1.

poškodených

Súhrn poškodených nukleotidov v géne Nth 1. Myšie (M) a potkanie (R) sekvencie sa porovnávajú. Odvodené aminokyseliny sú viditeľné vyššie (myš) a nižšie (potkan). Nukleotidové divergencie medzi myšacími a potkaními génovými sekvenciami Nth-1 sú označené obrátenými čiernymi písmenami (plný štvorec). Odvodené substitúcie aminokyselín sú tiež označené obrátenými (vyplnenými štvorcami) čiernymi písmenami. Poškodené nukleotidy v krysom géne Nth-1 sú zobrazené červenou farbou; Obrátené (plné štvorce) červené písmená označujú poškodené nukleotidy, ktoré sa detegovali na neprepisovanom vlákne, zatiaľ čo štvorcové červené písmená označujú tie, ktoré sa detegovali na transkribovanom vlákne. Podčiarknutie v exóne 1 označuje predbežný mitochondriálny cieľový signál, zatiaľ čo v exóne 2 označuje putatívny signál jadrovej lokalizácie. Štvorček Lys v exóne 4 označuje aktívne miesto pre aktivitu DNA glykozylázy, zatiaľ čo štvorcový Asp v exóne 5 označuje aktívne miesto pre aktivitu AP lyázy.

Organizácia chromatínových štruktúr v géne Nth 1

medzi

Farbenie etídiumbromidu na fragmenty štiepené mikrokokokovou nukleázou (MNáza). Chromatíny produkované z pečene, obličiek a sleziny sa štiepili MNázou, ako je uvedené (U/ml), a po extrakcii DNA, ako je opísané v časti Materiály a metódy, sa štiepené fragmenty DNA podrobili elektroforéze na 1,5% agarózovom géli.

oxidačne

Analýza miest štiepenia mikrokokokovou nukleázou (MNáza) v géne Nth1. Mikrokokové fragmenty DNA štiepené nukleázou pripravené z pečene, obličiek a sleziny, ako je opísané na obr. 3, sa analyzovali pomocou LM-PCR. Dráha označená „G-rebrík“ predstavuje guanínový rebrík, ako je opísané na obrázku 1. Odhadovaná poloha nukleozómovej fázy je zobrazená na pravej strane panelu. ( a ) Distribúcia miest rozštiepených mikrokokokovou nukleázou v exóne 1 génu Nth1. „Txn“ označuje polohu miesta predbežného začatia transkripcie. ( ) Distribúcia tých v exóne 3 génu Nth1. ( c ) Distribúcia tých v exóne 5 génu Nth1

diskusia

Proteínový segment kódovaný exónmi 1 a 2 je jedinečný pre cicavčí Nth 1 a predpokladá sa, že obsahuje jadrové a mitochondriálne cieľové signály a interakčné miesta pre ďalšie zložky opravného systému (Ikeda et al., 1998). Nedávno Klungland et al. (1999) ukázali, že proteín XPG aktivuje Nth1 u ľudí a S. pombe a stimuluje väzbu proteínu Nth1 na lézie obsahujúce DNA prostredníctvom nepriamej interakcie medzi Nth1 a XPG. U E. coli Nth 1 nebola pozorovaná žiadna aktivácia ani stimulácia pomocou XPG. Preto môžu mutácie v týchto oblastiach viesť k abnormálnej intracelulárnej lokalizácii mutovaného proteínu Nth1 alebo k poruche.

Materiály a metódy

Zvieratá

Šesťtýždňové krysy Wistar boli zakúpené od Seiwa Experimental Animal (Fukuoka, Japonsko). Dostali komerčnú potravu pre potkany (Clea, Tokio, Japonsko) a vodu z vodovodu ad libitum a použili sa po 4 dňoch aklimatizácie.

Chemikálie a Fpg

Fe (N03) 3, Na2NTA a DNA Extractor WB Kit boli zakúpené od spoločnosti Wako Biochemicals (Osaka, Japonsko). Piperidín a dimetylsulfát (DMS) boli od spoločnosti Nacalai Tesque (Kjóto, Japonsko). Roztok nitriloacetátu železitého (Fe-NTA) bol bezprostredne pred použitím podľa metód Awai et al. (1979) s drobnými úpravami. Stručne, Fe (N03) 3 a Na2NTA boli každý rozpustené vo vode Milli-Q a potom zmiešané v molárnom pomere 1: 4. PH bolo upravené na 7,4 pomocou NaHC03. Fpg bol získaný od Trevigen (katalógové č. 4040-100-01). Genomická DNA bola štiepená Fpg podľa pokynov výrobcu.

Liečba Fe-NTA

Celkom 30 zvierat bolo rozdelených do Fe-NTA a kontrolných skupín. V skupine s Fe-NTA boli zabití 1, 6, 24, 72 a 120 hodín po injekcii Fe-NTA (15 mg Fe/kg telesnej hmotnosti ip). V kontrolnej skupine boli zabití bez liečby. Každá podskupina obsahovala päť zvierat. Zvieratá sa usmrtili v éterovej anestézii. Obličky sa ihneď vybrali a potom sa použili na experimenty. Časť orgánu bola zmrazená a udržiavaná na -80 ° C.

Ligáciou sprostredkovaná PCR (LM-PCR)

DNA sa extrahovala z obličiek potkana (100 - 200 mg) pomocou súpravy DNA extraktor WB podľa metódy Nakae a kol. (1995). Extrahovaná DNA sa digerovala s Fpg, ako je opísané vyššie, alebo sa digerovala s 1 M piperidínom 30 minút pri 90 ° C (Maxam a Gilbert, 1977). Enzým Fpg rozoznáva formamidové pyrimidíny odvodené od adenínu, guanínu alebo 8-OH-Gua, ako aj niektoré oxidované pyrimidínové produkty, ako je 5-hydroxycytozín a 5-hydroxyuracil (Tchou et al., 1994). Na druhej strane, chemické činidlo piperidín môže štiepiť mnoho typov nukleotidových derivátov vrátane 8-OH-Gua a príbuzných zlúčenín (Chung et al., 1992), ako aj rôzne typy derivátov pripravených chemickými reakciami Maxama a Gilberta. Ako kontrolný guanínový rebrík reagoval alikvotný podiel genómovej DNA z kontrolných zvierat s DMS a štiepil sa piperidínom, ako je opísané vyššie. LM-PCR sa uskutočňovala tak, ako už bolo opísané (Konishi a kol., 1995; Nomoto a kol., 1995). Nukleotidové polohy štiepnych signálov odvodených z produktov LM-PCR sa určili z kontrolného guanínového rebríčka a sekvenčných informácií potkanieho génu Nth-1.

Sekvenčné informácie pre krysiu Nth-1 cDNA pokrývajú iba fragment 3'-329 bp (GenBank H33255). Sekvencia potkanieho génu Nth-1 potrebná na návrh primérov pre LM-PCR sa získala z produktov potkaních genómových PCR amplifikovaných primérmi založenými na nukleotidových úsekoch medzi Nth-1 cDNA. sa konzervovali u myší a ľudí (Aspinwall a kol., 1997; Hilbert a kol. 1997). Nukleotidové sekvencie jednotlivých primérov LM-PCR boli nasledujúce. Pre exón 1 génu Nthl: primer 1, 5'-gcctggagctaaagttccacg-3 '; Primer 2, 5'-cccctgcaggcgcagcg-3 '; Primer 3, 5'-ccctgcaggcgcagcgctacCTGC (veľké písmená označujú postupnosť exónu). Pre exón 3: primer 1, 5'-gtagtcagagatgcctgcctc-3 '; Primer 2, 5'-ctccagaacagtgccccctcttgg-3 '; Primer 3, 5'-ccagaacagtgccccctcttggttctgttgcc-3 '. Pre exón 5: primer 1, 5'-cagcaggatacctctccc-3 '; Primer 2, 5'-CaccaagctacactacCTGGGTAGCC-3 '; Primer 3, 5'-ccaagctakaktaktaCTGGGTAGCCACTCTTCCAGG-3 '. Priméry 1 a 2 sa použili na syntézu prvého vlákna a PCR amplifikáciu. Priméry 3 boli označené na 5 'konci y-32 P-ATP a použité na konečnú detekciu rebríka.

Trávenie mikrokokokovými nukleázami

Chromatínové frakcie z pečene, obličiek a sleziny z kontrolných potkanov sa pripravili podľa opisu (Gorsky a kol., 1986; Goldhamer a kol., 1995). Chromatínová suspenzia v tráviacom pufri, 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCI, 60 mM KCI, 1,5 mM DTT, 0,15 mM spermidín, 0,34 mM sacharóza, 0,1 mM PMSF a 1 mM M CaCl2 bol štiepený postupným riedením mikrokokokovej nukleázy (Worthington Biochemical Corp.) pri 20 ° C po dobu 5 minút. Po vyššie opísanej extrakcii DNA boli 5-konce miest štiepených MNázou fosforylované T4 polynukleotidkinázou a studeným ATP (McPherson a kol., 1993; Truss a kol., 1995). Elektroforéza extrahovanej DNA sa uskutočňovala na 1,5% agarózovom géli. Vzorky DNA sa podrobili LM-PCR, ako je opísané vyššie.

vďakyvzdania

Táto práca bola podporená grantmi na výskum rakoviny od japonského ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a techniky a spoločnosti Fukuoka Cancer Society, Fukuoka, Japonsko.