In vitro a in vivo analýzy antikarcinogénnej aktivity kurkumínu a decetén kurkumínu am

Z oblasti humánnej genetiky, teoretickej medicíny a biologických vied alebo klinickej medicíny Lekárskej fakulty Univerzity v Sársku, Homburg/Saar In vitro a in vivo analýzy antikarcinogénnej aktivity kurkumínu a deceténového kurkumínu na myšom malígnom melanóme Dizertačná práca na získanie doktorského titulu Lekárska fakulta prírodných vied UNIVERZITA DES SAARLAND 2014 predniesla: Indra Navina Dahmke narodená 1. decembra 1979 v Koblenzi

aktivity

Propagačný deň: dekan: prof. Dr. M.D. 1. reportér Menger: Prof. Dr. E. Meese, druhý spravodajca: PD Dr. M.W. Laschke

Na pamiatku môjho otca, ktorý ma priviedol k vede

Obsah I Obsah 1. Zhrnutie. 1 2. Úvod. 5 2.1. Malígny melanóm. 5 2.2. Kurkumín. 6 2.2.1. Chemické vlastnosti kurkumínu. 9 2.2.2. Farmakokinetika kurkumínu. 10 2.2.3. Farmakokinetika kurkumínu u ľudí. 11 2.2.4. Zlepšenie biologickej dostupnosti. 11 2.2.5. Toxicita. 12 2.2.6. Farmakodynamika kurkumínu u ľudí. 12 2.2.7. Molekulárne ciele kurkumínu. 13 2.3. MiRNA. 15 2.4. Vlastná otázka. 18 3. Materiál a metódy. 19 3.1. Laboratórne potreby. 19 3.2. Bunkové biologické metódy. 19 3.2.1. Použité bunkové línie. 19 3.2.2. Kultivácia buniek. 19 3.2.3. Izolácia primárnych ľudských periférnych mononukleárnych buniek. 20 3.2.4. Počet buniek 21 3.2.5. Stanovenie WST-1. 22 3.2.6. Prietokové cytometrické analýzy. 22 3.2.6.1. Stanovenie cytotoxicity. 24 3.2.6.2. Stanovenie fáz bunkového cyklu. 25 3.2.7. Fluorescenčná mikroskopická analýza. 25 3.3. Molekulárne biologické metódy. 26 3.3.1. Izolácia RNA zo vzoriek nádoru. 26 3.3.2. Analýza vysokého výkonu profilu mirna. 27 3.3.3. In silico analýza bunkových signálnych dráh. 29 3.3.4. Kvantitatívna PCR v reálnom čase od spoločnosti Mirnas. 29 3.3.4.1. Reverzný prepis. 29 3.3.4.2. Kvantitatívna real-time PCR (qrt-pcr). 30

Obsah III 4.2.2. Proliferácia a apoptóza v modeli komory dorzálnej kože. 58 4.2.3. Rast tumoru a neoangiogenéza v modeli tumoru boku. 58 4.2.4. Expresia NF-kB v bočných nádoroch. 60 4.2.5. Profil MiRNA bočných nádorov. 60 4.2.6. Expresia príslušných mirn v bunkových líniách melanómu. 64 4.2.7. Pravdepodobne regulované signálne dráhy. 65 4.2.8. Terče Mirna-205-5p. 66 5. Diskusia. 68 5.1. Účinky pyrolytických procesov na kurkumín. 68 5.2. Účinky kurkumínu v strave na melanóm. 71 5.3. Záver a výhľad. 79 6. Bibliografia. 81 7. Poďakovanie. 94 8. CV. 95 9. Publikácie. 96 10. Príloha. 97

Zoznam skratiek IV Zoznam skratiek Obr. Obrázok Akt proteínová kináza Akt, proteínová kináza B al. alii APC Alophycocyanin APS persulfate amonny Bcl-2 B-bunkovy lymfom 2 BDMC Bidemethoxycurcumin bp basepare BRAF v-raf murinovy ​​sarkom virusovy onkogen homolog B1, serin/treoninprotein kinasa B-Raf C uhlík Ca vápnik CD zhluk diferenciacie CdK c cyklin dependentna kináza súprava tyrozínkináza KIT Cl chlorid c-myc myc myelocytomatóza vírusový onkogén homológna COX-2 cyklooxygenáza 2 CTLA-4 cytotoxický antigén T-lymfocytov 4 Cur, CUR kurkumín redist. dvakrát destilovaná DEPC diethylpyrocarbonate DHC dihydrocurcumin DKC decetene kurkumín DMC demethoxycurcumin DMSO demetyl sulfoxid DNA kyselina deoxyribonuleic dNTP deoxyribonukleosidtrifosfátu DTT dithiothreitol dUTP 2-deoxyuridín efektívne epizóda 2-deoxyuridín prechod 1-polovica-epiphosphate, čoskoro epifytické proteín prechod, 5-k-1-bisfosfátu koncentráciu proteínu 50, transymptive-polovice-epiphosphate, 5-k-1-desoxyuridine, 5-k-1-bifosfát maximálna odozva. HER, EGFR receptor ľudského epidermálneho rastového faktora/erytroblastická leukémia vírusový onkogén homológny ESR1 estrogénový receptor alfa FACS fluorescenciou aktivované triedenie buniek FDA Správa potravín a liečiv g Gramm G1 Gap1 G2 Gap2

Zoznam skratiek V GFP zelený fluorescenčný proteín H vodík h hod Hepes kyselina 2- [4- (2-hydroxyetyl) piperazín-1-yl] etánsulfónová HIF-1α faktor indukovaný hypoxiou-1alfa hsa Homo sapiens ICAM-1 medzibunkový adhézny proteín-1, CD54 IgG imunoglobulín G ip intraperitoneálna IRAK1 s receptorom interleukínu-1 spojená s kinázou 1 i.v. intravenózna IVM intravitálna fluorescenčná mikroskopia IκB inhibítor kappa B kda kilodalton KEGG Kjótska encyklopédia génov a genómov kg kilogramov telesnej hmotnosti M 1 G malondialdehyd-DNA ma milliampér Me metylová skupina µg mikrogram µl mikroliter µm mikrometer minúta mg miligram mg horčíka micorna min. megahertz min mirisc mirna indukované tlmenie komplexu stredná stredná hodnota ml mililiter mm milimeter mmu Mus musculus mol Mol mrna messengerrna mtor cicavčí cieľ rapamycínu (serín/treonínová proteínkináza) n počet Na sodík NF-κB nukleárny faktor-kappa beta ng nanogram nm nanometer O atóm kyslíka ORA analýza nadmerného zastúpenia

Zoznam skratiek VI p53 nádorový proteín 53 PAGE polyakrylamidový gélový elektroforéza PBS posfátový pufrovaný soľný roztok PCAF P300/CBP asociovaný faktor PCNA proliferujúci bunkový jadrový antigén PCR polymerázová reťazová reakcia PECAM, CD31 molekula adhézie doštičiek endotelové bunky PI propídium jodid str. o. per os PPAR-γ peroxizómovým proliferátorom aktivovaný receptor-γ PTEN fosfatáza a tenzínový homológ PYR pyrolyzovaný kurkumín qrt-pcr kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase syntéza RNA ribonukleová kyselina S pozri nižšie SDS dodecylsulfát sodný SEM štandardná chyba priemernej špecificity SP1 transkripčný faktor proteín 1 Src tyrozínkináza Src (sarkóm) T ton t ton TBS-T fyziologický roztok pufrovaný Tris a tlmivý roztok Tween 20 TE tris-EDTA TNF-α tumor nekrotizujúci faktor-alfa TPA 12-0-tetradekanoylforbol-13-acetát Tris 2- Amino-2-hydroxymetyl-propán-1,3-diolový t-test Študentský t-test US ultrazvuk VAV protoonkogén vav VCAM-1 molekula adhézie vaskulárnych buniek-1, CD 106 w/v hmotnosť na objem WHO Svetová zdravotnícka organizácia WST- 1 vo vode rozpustný tetrazolium-1 xg n-násobné gravitačné zrýchlenie napr. napríklad C stupňov Celzia

Zhrnutie 2 a bunkové línie ľudského melanómu sa uskutočnili kvantitatívnou polymerázovou reťazovou reakciou v reálnom čase (qrt-pcr). Analýzy domnelých cieľov zrkadiel regulovaných diétnym kurkumínom ukázali, že sú nadmerne zastúpené v bunkových signálnych dráhach biosyntézy O-glykánov, spracovaní proteínov v endoplazmatickom retikulu a rôznych signálnych dráhach spojených s rakovinou. Analýzy Western blot ukázali, že anti-apoptotický B-bunkový CLL/lymfóm 2 (Bcl-2) a proliferujúci bunkový jadrový antigén (PCNA) boli významne znížené v nádoroch týchto cieľov liečených kurkumínom. Stručne povedané, výsledky tejto práce preukázali, že deceténový kurkumín, ktorý je toxickejší pre rakovinové bunky ako kurkumín, vzniká pri bežnom varení v domácnosti pyrolytickou degradáciou. Ďalej bola zistená zásadná zmena podpisu mirna u transplantovaných melanómov v dôsledku diétneho kurkumínu. Tu bola najviac regulovaná mmu-mir-205-5p. Bol dokázaný vplyv perorálne podávaného kurkumínu na dôležitú regulačnú sieť v nádoroch a zdôrazňuje potenciálny prínos kurkumínu pri liečbe malígneho melanómu.

Zhrnutie 4 bolo obohatené o biosyntézu o-glykánov, spracovanie proteínu endoplazmatického retikula a rôzne cesty spojené s rakovinou. Analýzy Western blot odhalili, že z týchto cieľov boli antiapoptotické B-bunkové CLL/lymfómy 2 (Bcl-2) a nukleárny antigén proliferujúcich buniek (PCNA) významne down-regulované v nádoroch liečených kurkumínom. Záverom možno konštatovať, že zistenia tejto práce ukazujú, že deketénový kurkumín, ktorý vzniká v dôsledku pyrolytickej degradácie pri bežnom varení v domácnosti, vykazuje silnejšiu toxicitu pre rakovinové bunky v porovnaní s kurkumínom. Diétny kurkumín navyše spôsobil hlbokú zmenu podpisu mirny pri štepenom melanóme, pričom najvýraznejšie bola zvýšená regulácia mmu-mir-205-5p. Bol zdokumentovaný vplyv orálne podávaného kurkumínu na dôležitú regulačnú sieť v nádoroch a zdôrazňuje potenciál kurkumínu v liečbe malígneho melanómu.

Úvod 7 Obrázok 2: Curcuma longa. A: Výkres rastliny curcuma (Köhler, 1887). B: Fotografie oddenkov a prášku kurkumy. Komerčne dostupný kurkumín zvyčajne pozostáva z asi 80% kurkumínu a obsahuje tiež medziprodukty rastlinnej biosyntézy s podobným spektrom účinku, ako je napríklad demetoxykurkumín (

17%) a bidemetoxykurkumín (

3%) (obr. 3). Zatiaľ čo v Európe a USA sa kurkumín používa hlavne ako farbivo do potravín (E100, prírodná žltá 3), jeho spotreba a použitie v tradičnej medicíne sú rozšírené v juhovýchodnej Ázii. Už viac ako 2000 rokov sa kurkumín používa v tradičnej ázijskej kuchyni ako hlavná zložka kari a na farbenie sladkostí a používa sa na lekárske ošetrenie infekcií a vnútorných chorôb (Ammon, 1991; Eigner a Scholz, 1999). S podielom 80% (okolo 800 000 t v roku 2010) je India hlavným svetovým producentom kurkumy, z ktorých 90% sa ďalej spracováva na domácom trhu (Universal Commodity Exchange, 2012). Priemerná spotreba je 2,0 - 2,5 g kurkumy za deň a osobu a zodpovedá príjmu až 100 mg kurkumínu (Chainani-Wu, 2003). Na porovnanie, podľa odhadov Európskeho úradu pre bezpečnosť potravín vo Veľkej Británii konzumujú dospelí 0,8 - 3,3 mg/kg telesnej hmotnosti denne (Európsky úrad pre bezpečnosť potravín, 2010).

Úvod 10 rôznych podielov trans-6- (4-hydroxy-3-metoxyfenyl) -2,4-dioxo-5-hexanalu, kyseliny ferulovej, feruloylmetánu a vanilínu (Wang et al., 1997). Kurkumín je ľahko rozpustný v organických rozpúšťadlách, ako sú alkoholy alebo demetylsulfoxid (DMSO), ale len s ťažkosťami vo vode. To vedie k zníženej bunkovej absorpcii v čreve a následne k zníženej biologickej dostupnosti. 2.2.2. Farmakokinetika kurkumínu Predklinické a klinické štúdie farmakokinetiky kurkumínu preukázali nízku systémovú biologickú dostupnosť a rýchly metabolizmus prvého prechodu a vylučovanie primárnej látky. Jedna z prvých štúdií Wahlströma a Blennowa (1978) ukázala, že orálne podávaný kurkumín potkanom Sprague-Dawley sa aktívne transportuje z pečene do žlče a 75% sa vylučuje stolicou. Iba malá časť bola zistiteľná v plazme a moči. Obrázok 6: Metabolizmus kurkumínu (upravené od Sharma, 2005) Biliárne vylučovanie kurkumínu je zase sprostredkované proteínom 2 spojeným s rezistenciou na viac liečiv (MRP2) (Lee et al., 2012). V in vitro experimentoch bol tiež

Materiál a spôsoby 21 sa premyli studeným PBS a bunky sa potom spočítali manuálne v počítacej komore Neubauer (hemocytometer). Pufr na lýzu erytrocytov: 788 mg (10 mm) Tris-HCl 4,41 g (165 mm) NH4CI chemikálie v 500 ml aqua bidistu. rozpustiť a skladovať pri 4 ° C 3.2.4. Počítanie buniek Na spočítanie buniek sa 10 ul bunkovej suspenzie zmiešalo s 10 ul trypánovej modrej (riediaci faktor: 2) a vitálne (nefarbené) bunky sa spočítali v počítacej komore Neubauer (obr. 10). Farbivo trypánová modrá preniká cez poškodené bunkové membrány a tým označuje bunky, ktoré nie sú dôležité. Druhý 10 ul alikvot bunkovej suspenzie sa zmiešal s Turkovým roztokom a pridal sa do počítacej komory Neubauera na stanovenie počtu bielych krviniek. Kyselina octová obsiahnutá v roztoku Türks lyžuje erytrocyty tak, že sú zafarbené na modro. Obrázok 10: Neubauerova počítacia komora. A: Schematické znázornenie hemocytometra v priereze. B: Schematické znázornenie počítacej oblasti. Kvadranty, ktoré sa majú započítať, sú vyznačené červenou farbou (Woermann, 2000). Pri výpočte dôležitých PBMC sa musí brať do úvahy objem kvapaliny v počítacej komore a zriedenie buniek v farbiacich roztokoch. Oblasť

MATERIÁLY A METÓDY 29 Na zistenie úrovne expresie mirny medzi kontrolnou a liečebnou skupinou sa použil nezávislý, obojstranný Studentov t-test. Vypočítané hodnoty P sa pri opakovanom testovaní korigovali s mierou falošných objavov (FDR) (Benjamini a Hochberg, 1995). Deregulované mirny s korigovanou hodnotou P o 20%, priemerom nádoru> 15 mm a rozvojom nekrózy tkaniva. Pokiaľ nie je uvedené inak, intervencie sa uskutočňovali v intraperitoneálnej anestézii ketamín-xylazínom (ketamín: 75 mg/kg, Ketanest, Pharmacia GmbH, Erlangen, Nemecko; xylazín: 15 mg/kg, Rompun, Bayer, Leverkusen, Nemecko). Po ukončení pokusov sa zvieratám podala dávka pentobarbitalu (200 mg)

Materiály a metódy 46 Obrázok 18: Intravitálna fluorescenčná mikroskopia. Inštalácia fluorescenčného mikroskopu (FM) s ortuťovou výbojkou (HBO), diaľkovými šošovkami (LDO) a systémom videodokumentácie s videokamerou (VK) a DVD rekordérom (DVD). Dáta boli vyhodnotené offline pomocou softvéru CapImage (Zeintl, Heidelberg, Nemecko). Analýzy zahŕňali meranie veľkosti nádoru [mm2] a funkčnej kapilárnej hustoty [cm/cm2]. Toto je definované ako celková dĺžka prekrvených ciev na zorné pole. V tejto práci bola analyzovaná funkčná kapilárna hustota kompletného tumorového sféroidu. 3.10. Model tumoru bokov Generácia tumorov bokov a ultrazvukové merania sa uskutočňovali s láskavou podporou Jeannette Rudzitis-Auth, Institute for Clinical-Experimental Surgery, Saarland University. 3.10.1. Tvorba bočných nádorov Aby sa vytvorili bočné nádory, boli samčekom myší C57BL/6 krátko urobené anestézie zmesou 4% izofluránu a kyslíka. Každá myš bola subkutánne injikovaná 1 x 105 melanómových buniek B78H1 na bok v objeme 50 ul PBS.

Použije sa materiál a metódy 50. V post hoc analýzach sa alfa chyba upravila podľa Bonferroniho, aby sa opravili opakované merania. Hodnota P