Malé nekódujúce RNA v regulone dvojzložkového systému CiaRH u Streptokoka
Malé nekódujúce RNA v regulone dvojzložkového systému CiaRH v dizertácii Streptococcus pneumoniae od Dipl.-Biol. Schválené katedrou biológie na Technickej univerzite v Kaiserslauterne za udelenie akademického titulu doktor prírodných vied. Márta Kovács predseda doktorskej komisie: prof. Dr. Matthias Hahn 1. reportér: Prof. Dr. Regine Hakenbeck 2. reportér: Prof. Dr. John A. Cullum Dátum vedeckej diskusie: 8. mája 2009 Kaiserslautern
Táto práca sa uskutočnila na oddelení mikrobiológie Katedry biológie na Technickej univerzite v Kaiserslauterne pod vedením prof. Dr. Regine Hakenbeck vyrobené.
Týmto potvrdzujem, Márto Kovács, že som pripravil túto prácu sám. Ubezpečujem vás, že som použil iba uvedené zdroje a zdroje. Kaiserslautern, 17. marca 2009
Obsah Obsah Strana Obsah 1 Zhrnutie 5 Skratky 7 1. Úvod 8 1.1 Streptococcus pneumoniae 8 1.2 Genetická kompetencia a lýza Streptococcus pneumoniae 10 1.3 Dvojzložkový systém CiaRH 13 1.4 Malé nekódujúce RNA 16 1.5 Cieľ tejto práce 22 2. Materiál 23 2.1 Bakteriálne kmene 23 2.2 Plazmidy 25 2.3 Oligonukleotidy 26 2.4 Kultivačné médiá 31 2.4.1 Médium CpH8 31 2.4.2 Médium THB 32 2.4.3 D Krvný agar 32 2.4.4 Médium LB 33 2.4.5 Médium 2xTY 33 2.5 Použité antibiotiká 34 3. Metódy 35 3.1 Mikrobiologické metódy 35 3.1.1 Dokumentácia rastu baktérií 35 3.1.2 Podmienky kultivácie 35 3.1.3 Zachovanie kmeňa 36 3.1.4 Mikroskopia 36 3.1.5 Transformácia Streptococcus pneumoniae 36 3.1.6 Testovanie kompetencie Streptococcus . pneumoniae 37 3.1.7 Transformácia Escherichia coli 37 1
Obsah 4.10 Skúmanie účinku jednotlivých cdrn na transláciu kombu 144 5. Diskusia 146 5.1 CiaRH regulované intergénne promótory a ich transkripty: 146 crny 5.2 Stratégie hľadania csrna cieľových génov 148 5.3 Validácia csrna cieľových génov in vivo 150 5.4 crniek s mrnami svojich cieľových génov 153 5.5 Vzťah medzi fenotypmi 156 asociovanými s CiaRH a crnami 5.6 Podobné účinky a mechanizmy v iných organizmoch 163 5.7 Výhľad 165 6. Bibliografia 167 4
1. Zdá sa, že úvod sa týka regulácie extracelulárnych adhezínov a faktorov vylučovanej virulencie (Kreikemeyer et al., 2001). Ďalšou regulačnou RNA je lokus pel. Tento lokus bol objavený analýzou transpozónovej knižnice a bol viditeľný pre svoj pleiotropný účinok na expresiu exoproteínov. Gén pre RNA je dlhý 459 bp, ďalší gén je sága kódovaný medzi pozíciami 147 až 308 bp. Môže sa však preukázať, že neprekladaná RNA a nie preložený produkt SagA ovplyvňuje expresiu faktorov virulencie (Mangold et al., 2004). Treťou známou malou RNA je RivX. Táto RNA sa javí ako produkt spracovania transkriptu rivrx. Aj keď aj tu je na transkripte ORF, bolo možné preukázať, že RNA a nie proteín má regulačný účinok na regulované gény. Táto RNA spúšťa pozitívny účinok na gény regulované Mga, čo je dôležitý regulátor virulencie (Roberts a Scott, 2007). 21. deň
2. Materiál 2.4 Kultivačné médium 2.4.1 Médium CpH8 (médium C) na kultiváciu Streptococcus pneumoniae Pri všetkých skúškach uskutočňovaných v tejto práci sa kmene Streptococcus pneumoniae pestovali v médiu CpH8 (Lacks & Hotchkiss, 1960). Jednotlivé komponenty tohto média sa vyrábali osobitne a podľa potreby sa pipetovali iba spolu. Jednotlivé zložky sa skladovali pri 4 ° C s vylúčením svetla. Tabuľka 2.17: Zloženie média CpH8 Zložka Množstvo [ml] Doplnok PreC 400 13 Glutamín [1 mg/ml] 10 Adams III 10 Pyruvát 2% 5 Fosfátový pufor 15 Kvasnicový extrakt 5% 9 Konečný objem 462 Tabuľka 2.18: Zloženie jednotlivých zložiek Zložka Ďalšie množstvo PreC Bezvodý roztok octanu sodného 1,2 g kasaminokyselín 5 g L-tryptofánu 5 mg L-cysteínu 50 mg H20 a 1000 ml doplnku upraveného na pH 7,5, autoklávované soli 3v1 60 ml glukózy 20% (hmotnosť/objem) 120 ml sacharózy 50% (hmotn./obj.) 6 ml adenozínu [2 mg/ml] 120 ml uridínu [2 mg/ml] 120 ml zložiek autoklávu jednotlivo, pipetujte ich spolu za sterilných podmienok Adams III Adams I 160 ml Adams II 40 ml asparagín 2 g cholínchlorid 0, 2 g CaCl2 [0,1 M] 1,6 ml H20 a 1 000 ml sterilnej filtrácie a uchováva sa s vylúčením ľahkého fosfátového pufra ph8 KH2P04 [1 M] 53 ml K 2 HPO 4 [1 M] 947 ml autoklávovania 31
2. Materiál 3 v 1 soli Adams I Adams II MgCl 2 x 6 h 2 O 100 g CaCl 2, bezvodý 0,5 g MnSO 4 x 4 h 2 O [0,1 M] 0,2 ml H20 a 1000 ml autoklávovania Biotín 0, 5 g kyseliny nikotínovej 150 mg pyridoxínu HCl 175 mg pantotenátu vápenatého 600 mg tiamínu HCl 160 mg riboflavínu 70 mg H 2 O a 1 000 ml sterilného filtra a skladuje sa bez prístupu svetla FeSO 4 x 7 h 2 O 500 mg CuSO 4 x 5 h 2 O 500 mg ZnSO 4 x7h20 500 mg MnCl2 x4h20 200 mg HCl konc. H20 10 ml a 1 000 ml sterilnej filtrácie a uchováva sa s vylúčením svetla. 2.4.2 Todd-Hewittovo médium (THB) Todd-Hewittovo médium je komplexné médium, ktoré sa často používa na pneumokoky a bolo pripravené na priame použitie (Difco, Detroit, USA). Médium bolo pripravené a autoklávované podľa pokynov výrobcu. Tabuľka 2.19: Zloženie média Todd-Hewitt Zložka Množstvo hovädzieho srdca (infúzia čerstvého tkaniva) 3,1 g peptónu 20 g glukózy 2 g NaCl 2 g uhličitanu sodného 2,5 g hydrogénfosforečnanu sodného 0,4 g 2,4,3 D krvného agaru Ako tuhé médium pre Na kultiváciu Streptococcus pneumoniae sa použil D krvný agar. Na tento účel sa D-agar autoklávoval a po ochladení na 48 ° C sa pridala defibrinovaná ovčia krv (Oxoid) na konečnú koncentráciu 3% (obj./obj.). Po pridaní akýchkoľvek prísad, ako sú antibiotiká, sa zmes zmiešala a vyliala do sterilných Petriho misiek. 32
2. Tabuľka materiálov 2.20: Zloženie zložky D krvného agaru glukózový baktopeptón neopeptónový kvasnicový extrakt NaCl Tris agar H20 množstvo 1 g 10 g 5 g 1,25 g 5 g 1,25 g 15 g až 1000 ml 2,4,4 LB médium Lauria-Bertani (LB) médium sa použilo na kultiváciu E. coli (Sambrook a kol., 1989). Na výrobu LB agaru sa do média pridalo 15 g/l agaru. Podľa potreby sa pridali vhodné antibiotiká a ďalšie aditíva. Tabuľka 2.21: Zloženie média LB Zložka Množstvo bactopeptónu 10 g NaCI 5 g kvasnicového extraktu 5 g H20 do 1000 ml 2,4,5 média 2xTY Médium 2xTY sa použilo na izoláciu menších množstiev plazmidu z E. coli. Tabuľka 2.22: Zloženie média TY Zložka Množstvo Baktopeptón 16 g NaCl 5 g kvasnicový extrakt 5 g H20 do 1 000 ml 33
2. Materiál 2.5 Použité antibiotiká Antibiotiká zhrnuté v tabuľke 2.23 sa pridali podľa potreby do pevného a kvapalného média. Po ich príprave sa zásobné roztoky sterilne filtrovali a skladovali pri -20 ° C. Tabuľka 2.23: Použité antibiotiká Antibiotické rozpúšťadlo Koncentrácia zásobného roztoku Tetracyklín 50% EtOH 3 mg/ml 3 µg/ml Konečná koncentrácia Ampicilín H20 20 mg/ml 100 µg/ml Spektinomycín H20 20 mg/ml 80 µg/ml Streptomycín H2 O 20 mg/ml 200 μg/ml Erytromycín 90% EtOH 1 mg/ml 1 μg/ml Kanamycín H20 20 mg/ml 200 μg/ml Chloramfenikol H20 1 mg/ml 1 μg/ml 34
4. Výsledky 1,0 Účinnosť transformácie% 0,8 0,6 0,4 0,2 R6 RK12345 RK123 RK45 R6 kiar: aad9 0,0 0 20 40 60 80 100 120 Hustota buniek [NU] Obrázok 4.24: Účinnosť transformácie rôznych CCN delečné kmene v porovnaní s divým typom S. pneumoniae R6 a S. pneumoniae R6 ciar: aad9. Hustota buniek v nefelo jednotkách je zobrazená na osi X. Účinnosť transformácie v percentách (podiel transformovaných buniek na počte živých klíčkov) je na osi Y. Divoký typ R6 je čierny, RK12345 je červený, RK123 je zelený, RK45 je tmavo modrý a S. pneumoniae R6 ciar: aad9 je zobrazený svetlomodrou farbou. Výsledky skúmania prirodzenej transformovateľnosti kmeňov RK12345, RK123 a RK45 naznačujú súvislosť medzi malými nekódujúcimi RNA a prirodzenou transformovateľnosťou S. pneumoniae R6. Všetky tri skúmané kmene vykazovali zníženú transformovateľnosť. Tento fenotyp nebolo možné pozorovať pri R6 ciar: aad9. Bolo možné určiť iba posun v špičke kompetencie v smere nižších hustôt buniek. Osemnásobné zníženie transformovateľnosti kmeňa RK12345 je v rozpore s úplnou transformovateľnosťou kmeňa s deletovaným klamom. 105
4. Výsledky 4.7.3 Stanovenie aktivity ß-galaktozidázy cieľového génu - fúzne proteíny LacZ ako funkcia cŕrn Aktivita cieľového génu - fúzne proteíny lacz ako funkcia cŕŕr sa stanovila pomocou testov ß-galaktozidázy. Na tento účel boli plazmidy vložené do genómu divokého typu S. pneumoniae R6 a csrna mutantu S. pneumoniae RK12345. Aktivita p-galaktozidázy sa merala pomocou celozrnných lyzátov príslušných kmeňov. Merania sa uskutočňovali v strednej exponenciálnej fáze pri hustote buniek Nephelo 80 a krátko po vstupe do stacionárnej fázy. Výsledky meraní sú uvedené na obrázku 4.30. R6 RK12345 20 T3comA 50 40 T3hsdS ß-Gal jednotky 15 10 5 ß-Gal jednotky 30 20 10 0 0 exp. Fázový stav Fáza exp. Fázový stav Fázové ß-Gal jednotky 80 60 40 20 T3spr1610 ß-Gal jednotky 10 000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 T3comC 1000 0 exp. Fázový stav Fáza 0 exp. Fázový stav Fáza 800 700 600 T3spr0081 8000 7000 6000 T3cibB ß-Gal jednotky 500 400 300 ß-Gal jednotky 5000 4000 3000 200 2000 100 1000 0 exp. Fázový stav Fáza 0 exp. Fázový stav Fáza 125
4. Výsledky 700 600 T3spr0231 200 180 160 T3blpY ß-Gal jednotky 500 400 300 200 100 ß-Gal jednotky 140 120 100 80 60 40 20 0 exp. Fázový stav Fáza 0 exp. Fázový stav Fázové jednotky ß-Gal 400 350 300 250 200 150 T3spr0822 ß-Gal jednotky 50 40 30 20 T3spr1932 100 50 10 0 0 exp. Fázový stav Fáza exp. Fázový stav Fáza 20 T3spr0265 80 T3spr1645 15 60 ß-Gal jednotiek 10 ß-Gal jednotiek 40 5 20 0 exp. Fázový stav Fáza 0 exp. Fázový stav Fáza 1000 800 PvegT ß-Gal jednotky 600 400 R6 RK12345 200 0 exp. Fázový stav Fáza Obrázok 4.30: β-galaktozidázové aktivity 12 klonovaných cieľových génov - fúznych proteínov lacz v divokom type S. pneumoniae R6 a v S. pneumoniae RK12345. Merania sa uskutočňovali v dvoch časových bodoch: v exponenciálnej fáze pri hustote buniek Nephelo 80 a krátko po vstupe do stacionárnej fázy. Jednotky sú definované ako uvoľnené nmol ONP/min/mg proteínu. Sú znázornené priemery najmenej 2 nezávislých experimentov. Aktivity fúznych proteínov cieľového génu - lacz v médiu C sú zobrazené čiernou farbou pre S. pneumoniae R6 a červenou farbou pre S. pneumoniae RK12345. Ako kontrola sa určila aktivita promótora P vegt u oboch kmeňov. 126
4. Výsledky Obrázok 4.39: Testy posunu pásma a analýza Northern blot interakčných komplexov comc-rna a csrna3. Na obrázkoch vyššie sú znázornené gély pásového posuvu zafarbené SYBRGreenII. Náplň gélu je taká, ako už bolo opísané. Interakčné pásma sú označené červenými šípkami. Na obrázkoch nižšie sú znázornené blotované gély. Na ľavom obrázku bola na detekciu použitá sonda špecifická pre csrna3. Na pravom obrázku bola membrána narezaná a rozrezaná. použité sondy špecifické pre htra. Blotované interakčné pásy sú označené červenými šípkami. Interakčný test so spr0081 Interakčné testy sa uskutočňovali so všetkými 5 formami. V csrna2, csrna3, csrna4 a csrna5 bolo možné detegovať jasné interakčné pásma. V týchto stopách bolo zároveň možné pozorovať zmiznutie spr0081-rna v jeho skutočnej výške chôdze. V csrna1 nebolo možné vidieť jasné pásy interakcie a taktiež sa nezmenilo pásmo spr0081. Spr0081-rna teda netvoril interakčný komplex s csrna1. Aj tu csrna1 tvorila pásy asi v dvojnásobnej výške (obrázok 4.40, pruh 5). Tieto pásy boli tiež viditeľné v posledných stopách negatívnej kontroly. 142
5. Diskusia 5. Diskusia 5.1 CiaRH-regulované intergénne promótory a ich transkripty: csrnas CiaRH-regulované intergénne promótory sú silne závislé od CiaR. Bez fungujúceho regulátora odozvy neexistuje prakticky žiadna expresia (Halfmann et al., 2007). Aktivity týchto promotérov sú uvedené v tabuľke 5.1. Tabuľka 5.1: Aktivita β-galaktozidázy vyplývajúca z CiaRH regulovaných intergénnych promótorov Promotéry R6 kiar: aad9 R6 (hmotn.)