Účinok čajového katechínu epigalokatechín galátu na energetický metabolizmus myši - PDF zadarmo

Nemecký inštitút pre výskum výživy (DIfE) Postupim - Rehbrücke, pracovná skupina pre farmakológiu Fyziológia energetického metabolizmu Účinok čajového katechínu epigalokatechín galátu na energetický metabolizmus myši Dizertačná práca pre získanie doktorského titulu (Dr. rer.nat.) Na Matematicko-prírodnej fakulte Univerzity v Postupime z Dipl .-Veda o výžive Maika Friedrich sa narodila 1. novembra 1978, Magdeburg Potsdam, február 2010

epigalokatechín

Toto dielo je licencované na základe licenčnej zmluvy Creative Commons: Uvedenie zdroja Žiadne komerčné použitie Žiadne prispôsobenie 3.0 Nemecko Podmienky licencie nájdete kliknutím na hypertextový odkaz: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/Publikované online na publikačnom serveri Univerzity v Postupime: URL http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2010/4815/ URN urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159 http: // nbn-resolving .org/urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159

mrna MRP NaOH NEFA NMR pa PAS PC PCR PDB PDE PDHx PEPCK PIG-B PK posol Ribonukleová kyselina Odolnosť proti viacerým liekom Proteín Hydroxid sodný neesterifikované mastné kyseliny neesterifikované mastné kyseliny Nukleárna magnetická rezonancia postabsorptív Kyselina jódová Schiffovo farbivo Kyselina jódové Schiffovo farbivo Dophorase PIG-B Schiffové farbivo Komplex pyruvátdehydrogenázy Fosfoenolpyruvátkarboxyláza Fenol-izoamylalkohol-guanidíniumizotiokyanát-merkaptoetanol Pyruvátkináza PLA 2 Fosfolipáza A 2 Plin Perilipín PO oxidačný čas reaktívny-reaktívny-reaktívny kyslík Karboxyláza SD Štandardná strava SGLT1 Na sodíku závislý transportér glukózy 1 SO oxidácia substrátu StK Metabolická klietka TG Triglycerid TM sušina UCP odpojujúci proteín VO 2 Spotreba kyslíka WAT ​​biele tukové tkanivo WHO Svetová zdravotnícka organizácia VII

Úvod Polyfenoly sú flavonoidy, ktoré sa zase delia na flavanoly a katechíny. Katechíny v zelenom čaji tvoria až 30% sušiny. Rozlišujú sa takto: (obr. 1-2): epikatechín (EC), epikatechín galát (ECG), epigalokatechín (EGC) a epigalokatechín galát (EGCG). Štrukturálne rozdiely vznikajú v počte hydroxylových skupín a v prítomnosti galoylovej skupiny. S podielom až 50% na celkovom obsahu katechínu je EGCG dominantným katechínom v zelenom čaji. Okrem katechínov obsahuje zelený čaj bielkoviny (15%), vlákninu (26%), ďalšie sacharidy (7%), lipidy (7%), minerály (5%), aminokyseliny (4%) a pigmenty (2%) (Cabrera a kol., 2006). Obr. 1-2: Chemická štruktúra hlavných zložiek zeleného čaju (Koo & Noh, 2007) Ďalšou zložkou zeleného čaju je kofeín, ktorý tvorí približne 3 6% (Yang & Landau, 2000). Šálka ​​zeleného čaju obsahuje medzi 20 a 100 mg EGCG a 20 40 mg kofeínu (Stangl et al., 2006; Khokhar & Magnusdottir, 2002). Rôzne čajové katechíny majú odlišnú biologickú aktivitu, pričom EGCG vykazuje najvyššiu aktivitu (Chen et al., 1997). Z čajových katechínov má najvyšší počet hydroxylových skupín na troch uhlíkových kruhoch, ktoré sú dôležité pre tvorbu vodíkových zlúčenín. Galloylová skupina obsiahnutá v molekule EGCG môže tiež interagovať s inými molekulami, napr. B. Zadajte radikály (Liao, 2001). 14

V úvode bol mimoriadny záujem o skúmanie polyfenolu EGCG, ktorý sa nachádza predovšetkým v zelenom čaji. Mnoho účinkov opísaných v literatúre sa pozorovalo po dlhodobom používaní. Nie je jasné, či sú zmeny v dlhodobých štúdiách spôsobené priamo EGCG alebo nepriamo v dôsledku redukcie tukov. Pre tu uskutočňované vyšetrenia sa preto zvolilo krátkodobé alebo strednodobé trvanie aplikácie, počas ktorého sa zmeny v zložení tela ešte jednoznačne neprejavili. Cieľom tejto práce bolo podrobne preskúmať vplyv čajového polyfenolu EGCG na energiu a metabolizmus substrátu po krátkodobej a strednodobej aplikácii. Za študijný model bola vybraná myš, pretože ona a ľudia sú si z hľadiska biologickej dostupnosti EGCG dosť podobné. Cieľom bolo zistiť, aký vplyv má EGCG na rôzne fyziologické parametre v myšom modeli po krátkodobej a strednodobej aplikácii. Energetický a tukový metabolizmus po krátkodobej a strednodobej aplikácii by sa mal preskúmať z hľadiska energetickej rovnováhy a na molekulárnej úrovni, aby sa odhalili možné mechanizmy. 23

Materiál a metódy Tabuľka 2-2: Zdroje výživy pre polosyntetické diéty s vysokým obsahom tukov Zloženie [g/100 g] Pokus 3 (pozri 2.2.3.3) Pokus 4 (pozri 2.2.3.4) Kazeín 1 20 18 Pšeničný škrob 2 40 43 Sacharóza 3 5 5 Tuk z palmových jadier 4 18 Ľanový olej 5 1 Svetlicový olej 6 1 Kukuričný olej 7 17 Celulóza 8 11 7 Minerálna zmes 9 5 5 Vitamínová zmes 10 2 2 Voda, ml 30 30 Energetický obsah [kj/g] 19,9 21,3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Trvalá mliečna rastlina Peiting GmbH, Landshut (86% surových bielkovín) Kröner GmbH, Ibbenbüren/Westfahlen Nordzucker GmbH, Uelzen OTHÜNA, Ostthüringer Nahrungsmittelwerk Gera GmbH, Gera LARU Langensiep & Ruckebier GmbH, Bottrop Kunella Feinkost GmbH, Cottbus Mazola Unilever Deutschland GmbH, Hamburg GmbH, Rosenberg Mineral-Trace Element Premix C1000 na 100 g: približne 930 mg; P, 730 mg; Mg, 80 mg; Na, 440 mg; K, 710 mg; S, 170 mg; Cl, 360 mg; Fe, 20 mg; Mn, 10 mg; Zn, 3 mg; Cu, 800 mg; J, 40 mg; F, 400 mg; Se, 20 mg; Co, 10 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) Vitamín premix C1000 na 100 g: A, 0,45 mg; Cholekalciferol, 1,13 mg; K3, 1 mg; Tiamín, 2 mg; Riboflavín, 2 mg; B-6, 1,5 mg; B-12, 3 mg; Niacín, 5 mg; Kyselina pantoténová, 5 mg, kyselina listová, 1 mg; Biotín, 20 mg; Cholínchlorid, 100 mg; kyselina p-aminobenzoová, 10 mg; Inositol, 10 mg; E, 16,4 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) 26

Materiál a metódy 2.2.3 Dizajn testu S cieľom preskúmať účinky EGCG sa uskutočnilo niekoľko testov na zvieratách s rôznym dizajnom štúdie. 2.2.3.1 Pokus 1: Vyšetrovanie krátkodobého a strednodobého vplyvu EGCG na parametre energetického metabolizmu V tomto experimente by sa mali skúmať krátkodobé a strednodobé účinky aplikácie EGCG na parametre energetického metabolizmu, najmä energetického metabolizmu. Za týmto účelom sa uskutočnili dva čiastkové testy (obr. 2-2). Obr. 2-2: Časový priebeh štúdií na zvieratách uskutočňovaných s cieľom zistiť vplyv EGCG na parametre energetického metabolizmu u myší po krátkodobej (1A) a strednodobej (1B) aplikácii NMR Stanovenie zloženia tela pomocou spektroskopie nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR) (pozri 2.2.5) ITK nepriama živočíšna kalorimetria; Stanovenie parametrov energetického obratu (pozri 2.2.6) Oxidácia substrátu SO pomocou stabilných izotopov (pozri 2.2.7.1) StK t metabolizmus usmrcovanie klietky 27

Materiál a metódy Obr. 2-4: Akumulácia 13 C vo vybraných orgánoch a tkanivách, ako aj vydychovaný vzduch u myší po prechode zo štandardnej stravy (SD) na 13 C stravu s vysokým obsahom tukov (HFD); DOB = Delta nad základnou skúškou EGCG Predbežný test vyústil do kŕmneho obdobia jedného týždňa na stanovenie začlenenia13C v závislosti od aplikácie EGCG. Aj tu sa myši zmenili z SD na polosyntetický HFD, ktorý ako jediný zdroj tuku obsahoval kukuričný olej (obr. 2-5). Základné informácie sú opísané v bode 2.2.7.2. EGCG sa podával s krmivom (skupiny: základná skupina (SD), kontrola, 0,25%, 0,50% EGCG (HFD), n = 8). Obr. 2-5: Návrh testu na vyšetrenie 13C inkorporácie dieteticky značených triglyceridov do myší. NMR stanovenie zloženia tela pomocou NMR-spektroskopie (pozri 2.2.5). Vzorka dýchacieho plynu na stanovenie obohatenia13C pomocou IRMS (pozri 2.2.7.1). t zabiť 30

30 l/h sada. Na udržanie konštantnej teploty okolia (22 ° C) boli dýchacie klietky umiestnené v klimatických skriniach (Vötsch Industrietechnik, Reiskirchen-Lindenstruth). Podiel spotreby 02 (VO2) a produkcie CO2 (VCO2) sa stanovil pre každé zviera v 6-minútovom intervale. Podľa ekv. 2-2 (Frenz, 1999). Myši dostali potravu o 16:00, aby sa zistil vplyv EGCG za postabsorpčných aj postprandiálnych podmienok. V krátkodobom experimente sa kŕmenie kombinovalo s orálnou aplikáciou EGCG. 36

Materiál a metódy Platňa sa pipetuje, pridá sa 150 ul enzýmového činidla (RGT), premieša sa a centrifuguje. Po inkubačnej dobe 10 minút pri laboratórnej teplote sa extinkcia vzoriek a štandardu merala proti slepému pokusu s reagentom (voda) pri 500 nm (Power Wave 340, BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall). Koncentrácia cholesterolu vo vzorkách plazmy bola vypočítaná pomocou lineárnej regresnej rovnice štandardnej série (rovnica 2-19). ymxn (Rov. 2-19) yxmn extinkčná koncentrácia sklon priamky priesečníka s osou y 2.5.1.2 Voľné mastné kyseliny Princíp Kvantitatívne stanovenie voľných mastných kyselín v plazme sa uskutočňovalo pomocou testu NEFA-C (Wako Chemicals GmbH, Neuss) . Princíp reakcie je uvedený v nasledujúcich rovniciach (rovnice 2-20 až rovnice 2-22). R COOH Acyl CoA syntetáza ATP CoA SH Acyl CoA AMP PP i (Rov. 2-20) Acyl CoA O Acyl CoA Oxidáza 2 2,3 trans Endol CoA H2O2 (Rov. 2-21) Peroxidáza 2 H2 02 4 Aminofénová zóna MEHA Chinónimín 4 H2O (Rov. 2-22) R-COOH ATP CoA-SH AMP PP i mastné kyseliny adenozíntrifosfátový koenzým A Kyselina adenozínmonofosfát fosforečná 50

Materiály a metódy ΔE blank (E2 E1) blank 2 (E3 E2) blank (ekv. 2-29) ΔE vzorka (E2 E1) vzorka 2 (E3 E2) vzorka (ekv. 2-30) Najskôr rozdiel medzi týmito tromi Merania extinkcie (E1-E3) určené pre hodnoty vzorky a slepého pokusu (rovnice 2-29 až rovnice 2-30). Toto sa používa na výpočet rozdielu medzi vzorkou a slepou hodnotou (Rov. 2-31). ΔE ΔE vzorka ΔE slepá (rovnica 2-31) Koncentrácia sa potom vypočítala pomocou hrúbky vrstvy podľa nasledujúcej rovnice (rovnica 2-32): c β HB V MW β HB ε dv 1000 ΔE g/l (rovnica 2 -32) V konečný objem (ml) MW molekulová hmotnosť -HB (104,1 g/mol) extinkčný koeficient formazanu pri 492 nm (19,9 l mol -1 cm -1) d hrúbka vrstvy (1 cm) v objem vzorky (ml) Nakoniec vypočítané koncentrácie triplikátov sa spriemerovali a zohľadnilo sa zriedenie vzoriek plazmy 1: 2. 2.5.2 Stanovenie triglyceridov v pečeni Na stanovenie obsahu triglyceridov v pečeni boli triglyceridy najskôr extrahované HB tlmivým roztokom. Extrahované triglyceridy sa potom mohli stanoviť pomocou súpravy na stanovenie triglyceridov (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen). 55

Materiál a metódy TE pufor Tris-HCl EDTA autoklávovaná, tj. 2 O upravená na pH 8,0, autokláv 10 mm 1 mm 10xMOPS MOPS octan sodný EDTA pH 5,5 7,0; autokláv (zmena farby na žltú) 200 mm 50 mm 10 mm 1xMOPS - elektroforetický tlmivý roztok 10xMOPS ad 1 l s autoklávovaným dh 2 O 100 ml denaturačný tlmivý roztok 10xMOPS 100 ul 37% formaldehyd 175 ul 50% formamid 500 μl ad 1 ml s autoklávovaným dh 2 O bežiaci tlmivý roztok glycerol 500 µl autoklávovanej dh 2 O 400 µl 10xMOPS 100 µl špachtľovej špičky brómfenolovej modrej riedenie etídiumbromidu 0,1% etídiumbromidu 50 ul autoklávovaného dh20 950 µl 2.6.4 Čistenie RNA pomocou digescie DNázou Aby sa minimalizovala možná kontaminácia RNA genómovou DNA, RNA extrakty purifikované súpravou TURBO bez DNA (Ambion/Applied Biosystems, Darmstadt). Z tohto dôvodu sa približne 10 ul RNA (medzi 5 až 40 pg RNA) zmiešalo so 7 ul vody ošetrenej DEPC, 2 ul pufra Turbo DNase a 1 ul DNázy po dobu 30 minút pri teplote 37 ° C v termálnom cyklovači (Peltier Thermal Cycler PTC-200, MJ Research Inc., Waltham, MA, USA). Potom sa k 65 pridali 2 ul činidla na deaktiváciu DNázy

Materiál a metódy Tab. 2-12: množstvo cdna série riedení na stanovenie účinnosti primeru koncentrácia 1 0,05 koncentrácia 2 0,20 koncentrácia 3 1 koncentrácia 4 5 koncentrácia 5 20 koncentrácia 6 50 množstvo cdna [ng] Grafické znázornenie Logaritmické počiatočné koncentrácie sérií riedenia (os x) oproti hodnotám CT (os y) viedli k regresnej priamke, ktorej zvýšenie sa použilo na výpočet účinnosti (Rov. 2-40, Vaerman a kol., 2004). Účinnosť bola zvyčajne 85 - 100%. E 10 1/m 1 (rov. 2-40) Relatívna kvantifikácia génovej expresie sa uskutočnila po normalizácii na referenčný gén (tu: 18SrRNA, rov. 2-41). ACT CT (cieľový gén) CT (18SrRNA) (rov. 2-41) Vypočítaná hodnota CT sa potom odpočítala od fiktívnej hodnoty 36 (rovnice 2-42). Tu sa predpokladá, že pri CT hodnote 36 nedôjde k amplifikácii 18SrRNA, pretože reakčné podmienky (napr. Koncentrácia primérov, koncentrácia MgCl2) už na konci PCR nie sú optimálne. AC 36 T AC AC (Rov. 2-42) Exponenciálne hodnoty CT boli prevedené na lineárnu formu zvýšením na výkon bázy 2 (Rov. 2-43). Relatívna génová expresia 2 C T (rovnica 2-43) 72